一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4～8小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；④根据检测后的特异性S扩增曲线和阈值(Ct?value)进行结果判断。与现有技术相比，本发明专利技术的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，为副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速、灵敏、特异检出提供重大技术保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种水产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧光定量 PCR检测方法。
技术介绍
近年来，食源性疾病呈现上升趋势，这类疾病主要由食源性致病菌引起，包括在水 产动物或养殖环境中长期存在的副溶血弧菌、单增李斯特菌及可通过食物传播的霍乱弧菌 等。然而，由于含菌量少、菌株变异大和检测方法的局限性等原因，往往使得传统检测方法 无法检出或者容易漏检。因此，寻求快速、灵敏、特异的方法来检测水产品中的副溶血弧菌、 霍乱弧菌和单增李斯特菌具有重要意义。食源性病原菌的检测技术经历了从传统的分离鉴定法、免疫检测技术，到分子生 物学方法的转变。目前，国内外对副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速检测技术 已有不少研究，如专利号为ZL03146896. 9的中国专利技术专利《一种快速检测副溶血弧菌的方 法》(授权公告号CN1280425C)，又如申请号为200710046637. 4的中国专利技术专利申请公开 《一种用于检测副溶血弧菌的方法》(公开号CN101140M3A)；针对霍乱弧菌的有申请号为 200710030446. 9的中国专利技术申请公开《霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒》(公 开号CN101153332A)，又如申请号为200810198809. 4的中国专利技术专利申请公开《霍乱弧菌 基因快速诊断试剂盒及其检测方法》(公开号CN101403005A)；针对单增李斯特菌的有申 请号为200610(^9348. 9的中国专利技术专利申请公开《一种快速检测样品中单增李斯特菌的 试剂盒》(公开号:CN101113465A)，又见申请号为200810201408. X的中国专利技术专利申请公 开《单增李斯特菌检测试剂盒及其检测方法》(公开号CN101381777A)；公开文献里也有多 重荧光定量PCR方面的文献，如申请号为200610068561.0的中国专利技术专利申请公开《食品 中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法》(公开号CN1967234A)。虽然现有技术已经作了很多研究，但是在同一个反应管内，利用具有多个激光通 道的荧光PCR检测仪，建立一种同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧 光定量PCR反应体系未见报道和相关文献公开。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种在水产品中同时 能检测副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种水产品中主要病原菌的多重 荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4 8小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA ；③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；④根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断，3 其中步骤③中的特异性的引物与TaqMan探针如下权利要求1. 一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4 8小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；④根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断， 其中步骤③中的特异性的引物与TaqMan探针如下菌株/ 登陆号引物/探针序列(5’-3’)长度 (bp)荧光标记Vp AB012596tlh-914-FGTGCGAAAGTGCTTGAGATG1125'FAM 3’ BHQltlh-1025-RAGAAGTTAGCGTCTCGAACAAGtlh-936-probeCGAGTTCATCAAGGCACAAGCGAVc AE004243vcc-600-FGTCTGGCCATGTGGGTAACT965'TAMRA 3' BHQ2vcc-695-RCACTCATTGTCCAGAGCGAAvcc-628-probeTACCGCTACTTAGCCGCCAACACTCALm AF253320hly-1459-FTTAGCTTGGGAATGGTGGAG985'TEXAS-RED 3' BHQ2hly-1556-RTTCGGATAAAGCGTAGTGCChly-1487-probeTTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGA探针的5’则要根据所采用的荧光定量PCR仪的多种荧光通道进行区别标记，探针的3’ 淬灭基团可以选择ECLIPSE或BHQ系列。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤①所述的增菌液中包括如下浓度 的培养基蛋白胨8 llg/L，酵母浸粉或牛肉浸粉17 18g/L，葡萄糖1 3g/L，磷酸二 氢钠2 3g/L，氯化钠25 35g/L，并且pH值保持在8. 1 8. 5。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤③中多重荧光定量PCR检测时的 反应体系含 Mg2+ 的 PCR buffer 2 3 μ L，dNTP 为 0. 4 0. 5 μ L，Taq 酶为 0. 5 0. 6 μ L， tlh、vcc、hly基因上下游引物各取6 6. 5pmol，针对tlh、vcc、hly基因的TaqMan探针各 取4 4. 5pmol，样品DNA取2 μ L，ddH20补充体积至20 μ L。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤③中多重荧光定量PCR检测时的 反应参数为95°C预变性3 5min ；95°C变性10 15sec，62°C退火并延伸45 60sec，40 个循环，在每个循环的62 °C退火并延伸阶段收集荧光信号。全文摘要一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4～8小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；④根据检测后的特异性S扩增曲线和阈值(Ct value)进行结果判断。与现有技术相比，本专利技术的优点在于可以实现一管多检的实际需要，为副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速、灵敏、特异检出提供重大技术保障。文档编号G01N21/64GK102121051SQ20101003961公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月7日 优先权日2010年1月7日专利技术者周向阳, 周秀锦, 徐君辉, 朱应伟, 沈飚, 王淑娜, 胡兴娟, 贝文联, 邵宏宏 申请人:中华人民共和国舟山出入境检验检疫局本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养４～８小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组ＤＮＡ；③利用特异性的引物与ＴａｑＭａｎ探针进行多重荧光定量ＰＣＲ检测；④根据检测后的特异性Ｓ扩增曲线和循环值进行结果判断，其中步骤③中的特异性的引物与ＴａｑＭａｎ探针如下：探针的５’则要根据所采用的荧光定量ＰＣＲ仪的多种荧光通道进行区别标记，探针的３’淬灭基团可以选择ＥＣＬＩＰＳＥ或ＢＨＱ系列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周向阳，王淑娜，沈飚，胡兴娟，贝文联，朱应伟，徐君辉，周秀锦，邵宏宏，
申请(专利权)人：中华人民共和国舟山出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：33
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