本发明专利技术提供了一种用于治疗和预防阿尔茨海默病(AD)的抗Aβ31-35抗体，制备方法：采用有机固相合成法合成氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Met的Aβ31-35片段，纯化，分析，与血蓝蛋白偶联，偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗Aβ31-35抗体。将该抗体用于在体AD动物实验或临床AD患者治疗，可有效避开APP上处于跨膜部分的结合位点，选择性清除细胞外的Aβ。与传统的针对AβN-末端的抗体相比，抗Aβ31-35抗体在预防和治疗AD中将具有副作用更小、特异性更强的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗Αβ抗体，具体属于一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗 A β 31-35抗体及其制备方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)，又名老年性痴呆，是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，主要表现为进行性认知功能障碍、学习和记忆能力丧失、个性改变， 晚期出现严重痴呆。AD最典型的病理特征是脑内出现大量、高密度的老年斑，其主要成分是淀粉样β蛋白(Amyloid β protein，Αβ)。Αβ的神经毒性作用已被广泛报道。如图 1所示，Αβ来自于跨膜的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)，但APP本身具有神经营养作用。传统的AD免疫疗法多使用针对A β N-末端的抗体，其虽然具有一定疗效，但副作用较大，能与APP位于细胞外的结构域结合从而伤害正常的ΑΡΡ。因此，目前临床实验已经暂停。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Αβ 31-35抗体及其制备方法，抗Αβ 31-35抗体在预防和治疗AD中应具有副作用小、特异性强的特点。本专利技术提供的一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Αβ 31-35抗体，通过包括如下步骤的方法制得(1)采用有机固相合成法合成氨基酸序列为IIe-IIe-Gly-Leu-Met的Αβ 31-35片段，固相载体用HMP树脂，保护氨基酸采用Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbony)，从多肽羧基端向氨基端合成，用TFA法裂解肽树脂，经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品 Aβ 31-35 片段；再用高效液才目反才目色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)进行纯化，分析；取纯化后的A β 31-35片段与血蓝蛋白偶联，偶联方法是用碳化二亚胺法进行缩合反应，得到 Αβ31-35片段-血蓝蛋白偶联物(抗原)；(2)用该偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗A β 31-35抗体。我们已经研究了抗Aβ 31-35抗体对脑室注射Aβ或神经细胞培养中加入Αβ所致脑功能或细胞伤害的保护效应，效果明显。这种抗体可以在制备治疗和预防阿尔茨海默病药物中应用。与现有技术相比本专利技术设计并制备针对A β 31-35序列的抗A β 31-35抗体，不仅能特异性封闭或阻断内源性Αβ发挥神经毒性作用的活性中心，而且更重要的是，由于抗 Αβ31-35抗体只能与细胞外的Αβ特异结合，不能与跨膜结构中APP分子上处于膜结构内相应的31-35序列接触，因而抗Αβ 31-35抗体在结合、清除Αβ的同时，可避免与跨膜蛋白APP的结合，从而不会影响APP发挥正常的促神经元生长、发育的作用。因此，与传统的针对A β N-末端的抗体相比，抗A β 31-35抗体在预防和治疗AD中将具有副作用更小、特异性更强的特点。附图说明图1人Αβ淀粉样前体蛋白(ΑΡΡ695)结构示意图。图2抗Αβ 31-35抗体预处理对Αβ 1-42引起的大鼠空间学习记忆行为伤害的影响。其中Α，各组大鼠在第1-4训练日的寻台潜伏期变化；B，第3训练日典型的大鼠游泳轨迹。图3抗Αβ 31-35抗体预处理对Αβ 1-42引起的大鼠海马LTP抑制的影响。其中 Α，连续记录的海马CAl区场电位幅度变化，显示0. 5nmol抗Αβ 31-35抗体对Aβ 1-42引起的LTP压抑具有部分恢复效应；B，不同处理组在高频刺激后三个时间点的幅度变化比较， 显示抗A β 31-35抗体对LTP的剂量依赖性保护效应。图4Α β 1-42对培养神经元的伤害作用和抗A β 31-35抗体的预处理效应。图5Αβ 31-35 (A)和Αβ 25_35(Β)对海马培养细胞细胞内钙水平的剂量依赖性升高效应。具体实施例方式实施例1用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗A β 31-35抗体的制备步骤(1)抗原制备采用有机固相合成法合成A β 31-35片段，固相载体用HMP树脂，保护氨基酸采用 Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbony)保护的氨基酸，从多肽羧基端向氨基端合成，用TFA 法裂解肽树脂，经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品A β 31-35片段。再用高效液相反相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)进行纯化，纯化后的样品再用HPLC分析，纯度为95%，将纯化后的A β 31-35片段冷冻抽干。取纯化后的Αβ 31-35片段与血蓝蛋白偶联，偶联方法是用碳化二亚胺法进行缩合反应，得到 Αβ 31_；35 片段-血蓝蛋白偶联物(抗原)。⑵抗体制备新西兰大白兔2只，雄性，经过检疫无病原菌的一级动物，体重为1. ^g，免疫前行耳静脉采血分离血清，冻存作为阴性对照血清。基础免疫取Aβ 31-35片段-血蓝蛋白偶联物ang/ml与等量CFA充分乳化后于两只兔背部皮下多点注射，每次免疫的抗原量为IOOOyg/只。加强免疫第一次免疫后间隔2周，再以lmg/lml抗原加等体积的IFA充分乳化后注入兔背部皮下多点加强免疫。而后每隔2周按第二次免疫法重复加强免疫6次。每次免疫后的第12天，行颈动脉插管取血，分离血清得到抗A β 31-35抗体，效价为1 16000。实施例2我们观察了抗A β 31-35抗体对脑室注射A β或神经细胞培养中加入A β所致脑功能或细胞伤害的保护效应。主要结果如下(I)Morris水迷宫实验图2显示了各组大鼠寻找水下平台的平均潜伏期㈧和典型的游泳轨迹(B)。与正常大鼠比较，脑室内注射5nmol Αβ 1_42可导致寻台潜伏期明显延长；不同浓度的抗A β 31-35抗体处理后，潜伏期和游泳距离缩短，特别是0. 5和5nmol的抗 Aβ 31-35抗体预处理组在各训练日均明显小于单独使用Aβ 1-42组(P < 0. 01)，表明Aβ 引起的行为学伤害可被抗A β 31-35抗体所逆转。(2)在体海马LTP预实验如图3所示，急性给予A β 1-42不影响高频刺激前测试刺激引起的fEPSP，但HFS诱导的LTP受到Αβ 1-42片段的显著压抑。联合给予不同浓度的抗Αβ 31-35抗体后，Aβ 1-42引起的LTP压抑效应被明显逆转。图3Α显示了 0. 5nmol的抗Αβ 31-35抗体对Αβ 1-42引起的LTP压抑的恢复效应。较高浓度(5nmol)抗Αβ31_35 抗体几乎完全逆转了 Αβ 1-42引起的LTP损害(图:3Β)。(3)细胞生存和细胞毒性预实验图4显示了 Aβ 1-42对培养神经元的损害作用和抗Αβ 31-35抗体的预处理效应。发现20μΜ Aβ 1-42预处理M小时后细胞存活率较对照组明显下降(绿色细胞为Calcein-AM染色标记活细胞，红色细胞为PI染色标记的死亡细胞)；给予20 μ M抗A β 31-35抗体预处理后可以明显抑制A β 1-42诱导的细胞损伤。(4)细胞内钙成像预实验初步结果显示，A β 31-35(图5A)的效应类似于 Αβ 25-35(图5B)，两者均能升高 且都具有一定程度的剂量依赖性。其中，给予 10 μ M禾口 20 μ M的Αβ 31-35时，荧光比本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的抗Ａβ３１－３５抗体，其特征在于，通过包括如下步骤的方法制得：（１）采用有机固相合成法合成氨基酸序列为Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ的Ａβ３１－３５片段，其中固相载体用ＨＭＰ树脂，保护氨基酸采用９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙ，从多肽羧基端向氨基端合成，用ＴＦＡ法裂解肽树脂，经减压蒸馏和乙醚萃取方法处理后得到粗品Ａβ３１－３５片段；再用高效液相反相色谱法进行纯化；取纯化后的Ａβ３１－３５片段与血蓝蛋白偶联，偶联方法是用碳化二亚胺法进行缩合反应，得到Ａβ３１－３５片段－血蓝蛋白偶联物；（２）用该偶联物对大白兔进行基础免疫和加强免疫后获得抗Ａβ３１－３５抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祁金顺，蔡红艳，杨威，王昭君，王晓晖，武美娜，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：14
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