用植物培养生产高甘露糖蛋白制造技术

用植物培养生产糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化、同时靶向具有ER信号和/或绕过高尔基体的蛋白的装置、系统和方法。本发明专利技术还涉及应用转基因植物根细胞、特别是胡萝卜细胞表达和生产有酶活性的高甘露糖溶酶体酶的载体和方法。更具体地说，本发明专利技术涉及高水平表达和大量生产生物活性高甘露糖葡糖脑苷脂酶(GCD)的宿主细胞、特别是转基因悬浮胡萝卜细胞、载体和方法。本发明专利技术还提供了用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生产高甘露糖蛋白的转化宿主细胞以及特别是用植物培养生产这些蛋白的方法和系统。
技术介绍
戈谢病(Gaucher' s disease)是最普遍的溶酶体贮积病。该病由隐性遗传性疾病(1号染色体q21_q31)所导致的葡糖脑苷脂酶(亦称葡萄糖神经酰胺酶)缺乏所引起， 葡糖脑苷脂酶是膜结合的溶酶体酶，催化糖鞘脂葡糖脑苷脂(葡萄糖神经酰胺，GlcCer)水解成葡萄糖和神经酰胺。戈谢病是因hGCD(人葡糖脑苷脂酶)基因(GBA)的点突变所引起，导致GlcCer在巨噬细胞的溶酶体内的累积。这种特征性贮藏细胞称为戈谢细胞，存在于肝、脾和骨髓。相关的临床症状包括严重肝脾肿大、贫血、血小板减少症和骨骼退化。编码人G⑶的基因于1985年首次测序(6)。该蛋白由源自536-聚体前肽的497 个氨基酸所组成。成熟的hGCD包含五个N-糖基化氨基酸的共有序列(Asn-X-Ser/Thr)。 这些位点中有四个位点正常是糖基化的。第一个位点的糖基化是产生活性蛋白所必需的。 已经对高甘露糖寡糖链和复合寡糖链进行了鉴定(7)。胎盘的hGCD含有7%的糖，其中的 20%为高甘露糖型(8)。生化和定点诱变的研究已经提供了对于折叠、激活物相互作用和活性位点位置有重要作用的区域和残基的原始图谱(9)。用神经氨酸苷酶处理胎盘hG⑶(生成脱唾液酸酶)，导致大鼠肝细胞清除和吸收速率随着肝的酶活性的增加而增加(Furbish等，1981，Biochim. Biophys. Acta 673 425-434)。这种经聚糖修饰的胎盘hGC目前用作治疗戈谢病的治疗药，生化和定点诱变的研究已经提供了对于折叠、激活物相互作用和活性位点位置有重要作用的区域和残基的原始图谱。戈谢病有三种不同的类型，均由hGC活性的水平确定。主要受该病影响的细胞是巨噬细胞，由于GlcCer的累积而高度增大，并因此称为“戈谢细胞(Gaucher cell) ”。对于GCD的缺陷是引起戈谢病的主要病因的证实，促使了开发酶替代疗法作为这种疾病的医治对策。De Duve首先建议，用外源生物活性酶替代失去的溶酶体酶，可能是治疗溶酶体贮积病的可行方法。从那时起，各项研究都表明酶替代疗法可能有益于治疗不同的溶酶体贮积病。用从胎盘制备的外源酶(β-葡糖脑苷脂酶)(阿糖脑苷酶(Ceredase) )，或者，最近用重组方法制备的外源酶(β_葡糖脑苷脂酶)(重组葡糖脑苷脂酶注射剂(Cerezyme) )，治疗I 型戈谢病的患者已显示了最好的成功。天然的未经修饰的葡糖脑苷脂酶是带有四个糖链的糖蛋白。这种蛋白不以机体内的吞噬细胞为靶，因此治疗价值是有限的。在戈谢病的现代治疗的开发中，用三种不同的糖苷酶处理序贯去除葡糖脑苷脂酶糖链上的末端糖。这种糖苷酶处理导致生成糖蛋白，其末端糖由甘露糖残基组成。由于吞噬细胞具有甘露糖受体，该受体识别带末端为甘露糖残基的寡糖链的糖蛋白和糖肽，葡糖脑苷脂酶的糖重建模(remodeling)改进了该酶对这些细胞的靴向性。如本文所指出的，糖基化对于hGCD的活性起着关键作用，因此无论使用衣霉素 (Sf9细胞)还是使用点突变消除所有的糖基化位点(Sf9和C0S-1细胞)使细胞系中所表达的hG⑶去糖基化，都导致酶活性完全丧失。此外，发现在大肠杆菌(E. coli)中所表达的hGCD是无活性的。进一步的研究表明，不同糖基化位点对于蛋白质活性的意义。除了糖基化在有效蛋白质活性中的作用以外，商业生产的酶含有聚糖序列修饰以利于特异性递药。将糖基化蛋白提取后重建模使其包括只含甘露糖的聚糖序列。人G⑶酶含有4个糖基化位点和22个赖氨酸。重组生产的酶(重组葡糖脑苷脂酶注射剂 )不同于胎盘酶(阿糖脑苷酶 )，其495位上的精氨酸已被组氨酸所取代。此外，重组GCD和胎盘GCD之间的寡糖组成不同，前者具有更多的岩藻糖和N-乙酰-萄糖胺残基，而后者仅保留一个高甘露糖链。如上所述，用三种不同的糖苷酶(神经氨酸酶、半乳糖苷酶和P-N乙酰-氨基葡糖苷酶)处理这两种类型的GCD以暴露末端甘露糖，从而能够靶向吞噬细胞。US 5，549，892中描述了一种包含重组生产的酶的药物制剂。应当注意的是，所有提及的参考文献都通过引用全部结合到本文中。现有的溶酶体酶替代疗法治疗的一个缺点在于酶的体内生物活性是不合需要的低，例如由于低的吸收，降低了累积底物的特异性细胞溶酶体的靶向性，并且溶酶体中体内作用的半寿期短。现有的G⑶重组酶的另一个主要缺点是它们的费用，它们给保健制度带来了沉重的经济负担。由于复杂的纯化方案和目前治疗所需的相当大的治疗药量导致了这些重组酶的高成本。因此，迫切需要降低G⑶的成本，使得这种挽救生命的治疗能向所有需要这种治疗的患者提供。药用蛋白传统上用哺乳动物或细菌表达系统来生产。最近十年，已用植物开发出了新的表达系统。这种方法是利用土壤杆菌属(Agrobacterium)，这是一种能够将单链DNA 分子(T-DNA)插入到植物基因组中的细菌。由于导入基因大量生产蛋白质和肽相对简单， 因此这种方法日益流行成为可替代的蛋白表达系统(1)。由于细菌表达系统里没有翻译后修饰，而植物的表达系统却能容易进行这些对蛋白表达和活性极为关键的修饰。哺乳动物和植物蛋白表达系统之间的一个主要差异在于蛋白质糖侧链的不同，这是由于生物合成途径的差异所致。糖基化对于蛋白质的活性、 折叠、稳定性、溶解度、对蛋白酶的敏感性、血清除率和抗原潜能都具有意义深远的影响。因此，任何用植物生产的蛋白质都要考虑植物糖基化的潜在后果。蛋白质糖基化分为两类N-联修饰和0-联修饰O)。这两种类型的差异在于聚糖部分所连接的氨基酸——N-联连接到天冬酰胺残基上，而0-联连接到丝氨酸或苏氨酸残基上。此外，每种类型的聚糖序列都具有独特的区别特征。就这两种类型而言，N-联糖基化比较丰富，而且其对蛋白质功能的影响已进行了深入的研究。另一方面，0-联聚糖相对稀少，而且关于它们对蛋白质的影响的可利用的信息并不多。专利技术概述
技术介绍
中没有教授或建议用植物培养选择性地生产糖基化蛋白的装置、系统或方法。
技术介绍
中也没有教授或建议用植物培养生产高甘露糖蛋白的装置、系统或方法。
技术介绍
中也没有教授或建议通过内质网(ER)用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。技术背景中也没有教授或建议在绕过高尔基体时通过内质网用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。
技术介绍
中也没有教授或建议通过使用ER信号绕过高尔基体用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。本专利技术克服了
技术介绍
中的这些缺点，提供了用植物培养生产糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化的蛋白、同时任选和优选地靶向(和/或别的操作处理)这种有ER 信号的蛋白的装置、系统和方法。虽然不希望受一种假说的束缚，但认为这种靶向性使得蛋白质绕过高尔基体并因此保留所需的糖基化，特别是高甘露糖糖基化。应当注意的是，本文所用的术语“植物培养物”包括培养生长的任何类型的转基因植物细胞和/或其它基因工程植物细胞。所述基因工程可任选是永久性的或是瞬时的。优选所述培养物的特征为不会长成完整植株的细胞，因此至少有一种植物的生物学结构不存在。任选和优选地，所述培养物的特征可为许多不同类型的植物细胞，但优选所述培养物的特征为一种特殊类型的植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的表达高甘露糖重组蛋白的植物细胞和药物可接受的载体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：Y·沙亚迪伊，G·鲍姆，D·巴特费德，S·哈斯穆里，A·勒科维茨，
申请(专利权)人：普罗塔里克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：IL