本发明专利技术公开了马流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原，细胞融合后通过有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选，获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11和3E10。两株单抗均能产生较高的腹水效价，Western-blot分析表明，所获得的2株单抗均能特异性识别EIV?NP重组蛋白；间接免疫荧光试验证明，2株单抗能够与天然EIV结合；ELISA测定，2株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。本发明专利技术为抗EIV?NP单抗的制备及后期EIV检测方法的建立提供了物质基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体，尤其涉及马流感病毒NP单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本专利技术还涉及该马流感病毒NP单克隆抗体在制备检测或诊断马流感病毒的试剂中的应用，属于马流感病毒的检测领域。
技术介绍
马、流感(Equine influenza, ΕΙ)是由马、流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起马属动物的急性呼吸性疾病，由于其恢复期长、治疗费用昂贵，给养马业带来了极大的经济损失(REEVE-JOHNSON L. Equine influenza in Australia . Vet Rec，2007， 161:635.)。因此，建立一种快速、有效的检测EI的方法对其早期预防和控制极为重要。马流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)具有种群和型特异性，是保守的结构蛋白，在病毒进化中变异率极低，对于易发生变异的流感病毒的诊断具有重要的应用价值。单克隆抗体在检测中以其高特异性、准确性和有效性备受人们青睐。故利用针对NP的单克隆抗体建立起来的检测技术广泛应用于流感病毒的诊断，尤其是多亚型和高突变的禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)。deBore等仅利用一株抗NP单抗建立的双抗体夹心ELISA方法和双抗体夹心阻断ELISA可以分别从病原水平和血清水平检测人、禽和马等不同动物来源的各亚型流感病毒(SIEBINGA J T and BOER GFD. Influenza A viral nucleoprotein detection in isolates from human and various animal species. Arch Virol, 1988,100 :75-87 ；deBOER G F,BACK W and 0STERHAUS A D M E. An ELISA for detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in humans and various animal species , Arch Virol，1990，115 :47-61.)。2008 年 Yang M 等运用流感病毒的 NP 单抗专利技术了一种快速检测针对AIV的探针，此单抗与NP结合后能被免疫荧光法、免疫组化法和免疫噬菌斑法展现出来(YANG Μ, BERHANE Y, SALO Τ, et al. Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza virus nucleoprotein. J Virol Methods, 2008，147 :265-274.)。而EI方面，尤其是中国国内，基于EIV抗NP单抗建立起的检测方法鲜有报道。与其它A型流感病毒一样，EIV极易变异，但是NP作为其重要的结构蛋白，却相当保守。应用单抗研究发现，所有不同动物来源的病毒株都有一个共同的抗原表位，针对此表位的单抗具有型特异性，利用该表位的单抗可检测不同动物来源的流感病毒，正如deBore等建立的双抗体夹心ELISA和双抗体夹心竞争ELISA。同时世界动物卫生组织(OIE)指出，在无分离病毒的实验室条件时，可采用EIV NP单抗进行抗原捕捉ELISA 直接检测鼻腔分泌物中的 EIV(COOK R F, SINCLAIR R and MUMF0RD J A. Detection of influenza nucleoprotein antigen in nasal secretions from horses infected with A/equine influenza(H3N8)viruses. J Virol Methods,1988, 20 1-12. LIVESAY G J, 0' NEILL Τ,HANNANT D，et al. The outbreak of equine influenza(H3N8)in the United Kingdom in 1989 !diagnostic use of an antigen capture ELISA. Vet Rec,1993,133 :515-519.)。因此，一种快速有效的诊断技术对于EIV的预防控制和流行病学研究极为重要。目前国内常用的检测EI的方法有病毒的分离、血凝血凝抑制试验、RT-PCR等，但进行大规模检测比较困难，应用也局限于专业实验室，很难在基层推广使用。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种抗马流感病毒NP单克隆抗体；本专利技术目的之二是提供分泌该抗马流感病毒NP单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之三是将上述抗的抗马流感病毒NP单克隆抗体应用于制备成检测马流感病毒抗原或抗体的有关试剂。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原，经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经4次有限稀释法克隆和间接 ELISA法筛选，获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11和3E10。其中，杂交瘤细胞株2G11的微生物保藏号是CGMCC NO. 4611 ；其分类命名为杂交瘤细胞株；保藏时间是2011年2月23日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。亚类鉴定结果显示，单抗2G11为IgGl亚型，单抗3E10为IgGh亚型，轻链均为 κ链。经间接ELISA检测，单抗效价分别为上清液分别是1 640、1 640，腹水分别是 1 409600,1 204800。Western-blot分析表明，获得的2株单抗均能特异性识别EIV NP 重组蛋白；间接免疫荧光试验证明，2株单抗能够与天然EIV结合；ELISA测定，2株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果为2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别是4. 39 X IO6M"1和2. 2 X IO6M^10 总之，本专利技术两株单抗均能产生较高的腹水效价，都与EIV有很好的亲和力。本专利技术为抗EIVNP单抗的制备及后期EIV检测方法的建立提供了物质基础。附图说明图1抗EIV NP单克隆抗体Wfestern blot分析；M 蛋白质分子质量标准；1 :NP重组蛋白；2 :His标签。图2本专利技术单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定结果；1 3 接毒的MDCK分别与单抗 2G11、3E10、4A1的间接免疫荧光反应结果；4 接毒的MDCK与SP2/0的间接免疫荧光反应结^ ο图3杂交瘤细胞与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图。 具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例本专利技术单克隆抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株分泌抗马流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣ ＮＯ．４６１１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭巍，相文华，赵立平，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93
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