本发明专利技术涉及花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2及其编码基因与应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。本发明专利技术首次从花生中克隆到了DGAT2基因的全长序列，命名为AhDGAT2(Arachis?hypogaea?DGAT)。并在不同花生品种中获得8个DGAT2的同源基因，分别命名为AhDGAT2a，AhDGAT2b，AhDGAT2c，AhDGATT2d，AhDGAT2e，AhDGAT2f，AhDGAT2g和AhDGAT2h。上述基因在其编码蛋白的N-端有个别氨基酸的差异，而其C-端完全相同。该基因可用于油料作物转基因育种，提高油料作物的油份含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2及其编码基因与应用，属于分子生物学和生物技术
技术介绍
花生是我国重要的油料和经济作物之一，种植面积约502. 5万公顷，总产量居世界首位。花生仁含脂50%左右，在几种主要食用油料作物中，其脂肪含量仅次于芝麻，而高于油菜籽、大豆和棉籽。植物油脂(三酰甘油)是油料植物中最多和最重要的有机化合物之一，不仅在植物生长、发育和繁衍过程中扮演着重要的角色，而且作为一种可再生的生物能源产品，具有非常广泛的应用。植物油是食用脂类的主要来源，约占全世界脂类消耗的 75%，而且植物油所含的很多单不饱和脂肪酸例如油酸，比饱和脂肪酸具有更高的营养价值。花生种子脂肪酸组成主要包括棕榈酸、油酸和亚油酸，油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的含量高达80%以上，其中油酸含量最高，达42% -68%，是大豆油、葵花子油和玉米油等其它植物油的2-3倍。因此，对花生脂肪酸合成进行系统而全面的研究具有重要的理论意义和实用价值。随着分子生物学和基因工程技术的发展，现代遗传学和分子育种学已逐渐取代传统育种，广泛应用于作物产量和品质性状的改良。人们希望通过基因工程等生物技术手段改良作物，缩短育种周期，加速新种质或品种的繁育。近年来，国内外学者对脂肪酸生物合成途径进行了大量研究，克隆出许多脂肪酸合成途径及其关键酶基因，初步阐明了脂肪酸合成代谢规律，并在此基础上利用基因工程方法调控植物种子脂肪酸代谢途径、改变脂肪酸组成，从而提高并改善了植物种子脂肪酸含量与品质。甘油三酯(TAG)是植物种子的主要储存脂类，DGAT是TAG合成途径的限速酶，所以 DGAT对种子发育以及油脂积累具有重要作用。通常认为，DGAT在植物种子发育过程中影响种子油分含量、脂肪酸组成以及种子重量等。DGAT是一个较大的基因家族。到目前为止，在植物中共发现3种类型的DGAT基因，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3。其中DGATl家族成员最多，只存在于动物和植物中。目前已经在拟南芥、油菜、蓖麻、烟草、大豆、百脉根等植物克隆到了 DGATl基因。DGAT2基因家族的成员在动物，植物和酵母中都存在，并且与DGATl基因家族没有明显的相关性。目前对植物DGAT2的研究较少，仅在拟南芥、油菜、蓖麻等少数植物中克隆出来。作为DGAT基因家族的新成员，DGAT3基因目前只在花生中发现，其编码蛋白序列与前两种DGAT家族成员同源性很低，但是具有类似的DGAT蛋白功能基序。如公开号为CN 1712527A(申请号为200410049633. 8)公开了大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因与应用，该专利技术所提供的大豆二酰甘油酰基转移酶，是序列表中SEQ ID N2 :2的氨基酸残基序列或与序列表中SEQ ID N2 :2的氨基酸残基序列具有至少95%的同源性且具有与SEQ ID Na :2相同活性的由SEQ ID Na :2衍生的蛋白质，或将SEQ ID Na 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No 2相同活性的由SEQ ID N2 :2衍生的蛋白质。在植物中过量表达DGAT基因能够显著提高种子的平均重量和含油量，而抑制其表达则能够使TAG含量及油分含量同时降低，并且使脂肪酸组成改变。在野生型拟南芥中过量表达AtDGATl基因，可以使DGATl的转录水平和活性明显提高(10% 70% )，油脂积累增加，种子平均重量增加。在大豆中过量表达Umbelopsis ramanniana的DGAT2A基因可以使大豆成熟种子含油量增加。在花生克隆到了 DGAT3基因，该基因与DGATl和DGAT2基因家族的相似性不足 10%，但是其编码蛋白具有类似的DGAT蛋白功能基序，并且与TAG合成密切相关。另外，该基因定位于细胞质中，而DGATl和DGAT2是定位于内质网上的。然而到目前为止，在花生中还没有任何关于DGATl与DGAT2的信息。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，首次从花生中克隆得到了 TAG合成途径限速酶 DGAT2基因的全编码区cDNA，并且命名为AhDGAT2 (Arachis hypogaea DGAT2)基因。对不同花生品种的DGAT2基因进行多次测序，结果表明，在花生的不同种属间总共存在8种类型的同源基因，分别命名为AhDGATh h，这8条同源基因编码的蛋白氨基酸序列在其C-端高度保守，仅在N-端有个别氨基酸的差异(图1)。该基因通过构建植物过量表达载体，利用农杆菌介导的侵染法转化野生烟草，可使转基因烟草叶片与种子脂肪酸含量明显增加， 脂肪酸组成改变。该基因可用于油料作物转基因育种，提高其含油量并改善其脂肪酸成分。编码花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2的基因AhDGAT2，该基因分子选自(a)核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的核酸分子；(b)编码如SEQ ID NO. 2所示多肽的核酸分子，或者，编码与SEQ ID NO. 2所示多肽同源性为99. 55%及以上相同功能的多肽的核酸分子。所述(b)中，同源性为99. 55%及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO. 2， 第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、 第26位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。所述(b)中，同源性为99. 55%及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2，该转移酶为SEQ ID N0. 2所示的多肽，或者，同源性为99. 55%及以上的相同功能的多肽。所述同源性为99. 55%及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID N0. 2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第沈位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。所述同源性为99. 55%及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID N0. 3、 SEQ IDN0. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 9 所示。本专利技术AhDGAT2基因cDNA全长为120汕？，其中开放阅读框部分为10(^bp，因此其编码翻译的蛋白质具有334个氨基酸，将此序列在Genbank数据库中进行检索，表明与已发表的卫矛DGAT2蛋白以及拟南芥DGAT2蛋白相比，氨基酸相似性分别为66. 17%与60. 78%，并且具有类似的DGAT蛋白结构域，如图2所示，黑色表示相同的氨基酸残基。表明本专利技术已经克隆得到了花生中编码DGAT2蛋白的基因。Genbank登记号及其物种来源如下EaDAGT2 (卫矛，ADF57328. 1)，AtDGAT2 (拟南芥，AAK32844. 1)。一种含有上述基因AhDGAT2的表达载体。含有上述基因AhDGAT2或上述表达载体的重组细胞。上述花生二酰甘油酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．编码花生二酰甘油酰基转移酶ＤＧＡＴ２的基因ＡｈＤＧＡＴ２，该基因分子选自：（ａ）核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核酸分子；（ｂ）编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示多肽的核酸分子，或者，编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示多肽同源性为９９．５５％及以上相同功能的多肽的核酸分子。
【技术特征摘要】
1.编码花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2的基因AhDGAT2，该基因分子选自(a)核苷酸序列如SEQID NO. 1所示的核酸分子；(b)编码如SEQID NO. 2所示多肽的核酸分子，或者，编码与SEQ ID NO. 2所示多肽同源性为99. 55%及以上相同功能的多肽的核酸分子。2.如权利要求1所述的基因AhDGAT2，其特征在于，所述(b)中，同源性为99.55%及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO. 2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第沈位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。3.如权利要求2所述的基因AhDGAT2，其特征在于，所述(b)中，同源性为99.55 %及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 9 所示。4.花生二酰甘油酰基转移酶DG...
【专利技术属性】
技术研发人员：毕玉平，彭振英，王龙龙，纪鸿飞，李兰，陈高，单雷，
申请(专利权)人：山东省农业科学院高新技术研究中心，
类型：发明
国别省市：88
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