本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了荷花植物络合素合酶基因NnPCS1及其植物表达载体和构建方法。荷花植物络合素合酶基因NnPCS1，序列为SEQ?ID?NO.1。NnPCS1是一个新的耐重金属基因，该基因可提高植物耐重金属性。荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体，由所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1与植物表达载体构成。本发明专利技术NnPCS1的植物表达载体载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐重金属新种质，提高植物的耐重金属性，可用于进行植物品种改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及荷花植物络合素合酶基因NnPCSl及其植物表达载体和构建方法。
技术介绍
重金属污染是环境污染的主要方面。据统计，我国受Cd、AS、Cr、I^等重金属污染的耕地面积近2000万hm2，约占耕地总面积的1/5 ；其中工业“三废”污染耕地1000万hm2， 污水灌溉的农田面积已达330多万hm2。因此重金属在环境中的分布、迁移、转化一直是环境科学领域的研究热点之一 。近年来利用植物修复重金属污染的土壤和水体的提出， 使绿色植物的应用超越了过去只是作为金属矿藏指示植物或重金属超富集植物的使用范围。相对于传统的物理化学技术及微生物处理技术而言，植物修复技术以其成本低廉、不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等独特优势，备受国内外学术界和产业界的密切关注。荷花(Nelumbo nucifera)，又称中国莲，属睡莲科莲属大型多年生挺水植物，是中国十大传统名花之一，具有极高的观赏价值和经济价值，多分布于淡水湖泊地区，耐水淹、抗性强，深受各国人民喜爱。植物络合素(phytochelatimPC)是一类被广泛研究的配体。PC是一类富含巯基的螯合多肽，在植物界广泛存在，可与金属离子螯合成稳定的硫肽复合物，这些复合物通过转运蛋白能够被运输到胞外，或将其储存在液泡内，降低对植物的毒害，使植物能够吸收和累积更多的污染物，提高修复效率 ]。植物络合素基因(PCS)是一类由重金属离子诱导的基因，在解除重金属离子的毒害、维持组织中金属离子的稳态以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起重要作用tt]。PCSl基因最早在两个植物中克隆出来，即拟南芥和小麦，然后依次从印度芥菜和 Ni超积累植株天蓝遏蓝菜克隆出来，拟南芥AtPCSl基因的功能和耐重金属机理进行了较为深入的研究。在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将植物络合素合酶基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐重金属的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个新的植物络合素合酶基因NnPCSl，解决提高大型观赏水生花卉荷花耐重金属性，修复水体污染的问题，本专利技术还提供该植物络合素合酶基因NnPCSl的植物表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐重金属新种质，可用于植物品种改良。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现荷花植物络合素合酶基因NnPCSl，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。荷花植物络合素合酶基因NnPCSl的植物表达载体，由所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl与植物表达载体构成。所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl的植物表达载体优选将经Bam I和Mc I 双酶切的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl插入到植物表达载体pCAMBIA1301-220得到的。所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl植物表达载体的构建方法，包括如下步骤(1)设计引物NnPCSl-ZF和NnPCSl-ZR，以冬荷cDNA为模板，用高保真酶进行PCR 反应，扩增上游和下游分别引入Bam I和Mc I酶切位点的NnPCSl基因，其中上游引物 NnPCSl-ZF 序列为 SEQ ID NO. 2，下游引物 NnPCSl-ZR 序列为 SEQ ID NO. 3 ；(2)将步骤(1)的PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞， 提取阳性质粒 PMD19-T Simple-NnPCSl ；(3)禾Ij 用 Bam I 和 Sac I 对 pMD19_T Simple-NnPCSl 和植物表达载体 PCAMBIA1301-220 分别进行双酶切，连接 Bam I 禾Π Sac I 双酶切 pMD19_T Simple-NnPCSl 得到的NnPCSl片段与Bam I和Me I双酶切pCAMBIA1301_220得到的大片段，转化T0P10感受态细胞，阳性质粒即为荷花植物络合素合酶基因NnPCSl植物表达载体 pCAMBIA1301-220-NnPCSl。所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl在提高植物的耐重金属性中的应用。所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl的植物表达载体在提高植物的耐重金属性中的应用。其中，所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl的植物表达载体优选将经Bam I和 Sac I双酶切的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl插入到植物表达载体pCAMBIA1301_220得到的。本专利技术的有益效果1.本专利技术提供的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl是一个新的耐重金属基因，该基因可提高植物耐重金属性。2.本专利技术构建的荷花植物络合素合酶基因NnPCSl植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐重金属新种质，提高植物的耐重金属性，可用于进行植物品种改良。附图说明图1 NnPCSl琼脂糖凝胶电泳分析M =DNA Marker ；1 =NnPCSl ；2 :pMD 19-T Simple-NnPCSl 质粒 BamH I 和 c I 双酶切；3 :pCAMBIA1301-220-NnPCSl表达载体质粒BamH I和&ic I双酶切电泳检测图。图2植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCSl构建方案3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定结果，WT代表野生型拟南芥，pcsl pcs8代表八个转基因拟南芥株系。图4野生型与转基因拟南芥qRT-PCR鉴定结果，WT代表野生型拟南芥，pcsl pcs8代表八个转基因拟南芥株系。图5野生型与转基因拟南芥重金属镉含量测定。具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1 NnPCSl的克隆选用荷花品种‘冬荷，(Nelumbonucifera Gaertn. ‘Donghe，)作为材料，用 400 μ MCdCl2处理生长至6到8片叶片期的‘冬荷’，3小时后取其嫩叶，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取 IygS RNA反转录成cDNA。以提取的叶片cDNA为模板，设计引物NnPCSl-F和NnPCSl-R进行PCR反应上游引物NnPCSl-F :ATGGCGATGGCAGGTCTATACAGGC (SEQ ID NO. 4)下游引物NnPCSl-R :AGAGACTGAAGGTGTGCTGAGGCCA (SEQ ID NO. 5)50yL 反应体系10XRCR Buffer 5· 0 μ L，NnPCSl-F、NnPCSl-R 弓 | 物各 1. 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．荷花植物络合素合酶基因ＮｎＰＣＳ１，其特征在于该基因的序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆磊，顾春笋，陈发棣，陈素梅，陈思思，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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