本发明专利技术布鲁氏菌GroEL蛋白的应用以及重组表达布鲁氏菌GroEL蛋白的方法，公开了布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用以及一种重组表达布鲁氏菌保护性抗原GroEL的过程。实验证明布鲁氏菌GroEL蛋白和佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体，激发细胞免疫，并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果，可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。本发明专利技术将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种布鲁氏菌GroEL蛋白的重组表达方法及其作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
技术介绍
布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病(简称布病)是典型的人兽共患传染病，给我国畜牧业生产造成了巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。 布病是一种慢性传染性疾病，预防该病的发生是控制该病的重要措施。目前，布病的预防主要是通过接种疫苗来实现。灭活和减毒布鲁氏菌病原体制备的疫苗，免疫动物后虽收到了有效免疫应答及免疫保护效果，但存在着接种后强烈过敏反应、免疫与感染难以鉴别诊断以及个别情况下出现菌毒恢复等难题，至今难以给人接种。因此，寻找安全、有效的布病新一代疫苗成为近几年的研究热点。和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗具有靶向性、安全性的特点，且其批量制作容易、 费用低，并可解决传统疫苗安全性的问题，另外，亚单位疫苗可在诊断学上区分免疫接种和自然感染。为了发展亚单位疫苗，对保护性抗原的筛选和评价成了最主要的任务。人们陆续对部分布鲁氏菌的表面抗原及胞内蛋白的免疫保护性进行了评价。但到目前为止，仅仅只发现了少数几个具有免疫保护性的蛋白，如L7/L12核糖体蛋白、Cu-^i超氧化物歧化酶蛋白、胞质蛋白P39、31kDa外膜蛋白等。因此，鉴定和筛选新的保护性抗原，将为布鲁氏菌亚单位疫苗的研究奠定基础。前人对于布鲁氏菌GroEL蛋白的研究，以GroEL蛋白与布鲁氏菌胞内生存的关系为主(参考文献 1 Teixeira-Gomes A. P. , Cloeckaert A. , Zygmunt M. S. Characterization of heat, oxidative, and acid stress responses in Brucella melitensis. Infect Immun，2000，68 :2954-2961.参考文献 2 :Lin J.，Ficht T. A. Protein synthesis in Brucella abortus induced during macrophage infection. Infect Immun,1995,63 1409-1414.)。Leclerq S及同事将布鲁氏菌GroEL基因克隆至哺乳系统表达载体构建DNA 疫苗，但是结果显示，该DNA疫苗仅能诱导Thl型免疫应答，却无免疫保护性(Baloglu S.， Toth T. , Schurig G. ,Sriranganathan N. ,Boyle S. Humoral immune response of BALB/ c mice to a vaccinia virus recombinant expressing Brucella abortus GroEL does not correlate with protection against a B. abortus challenge. Vet Microbiol,2000, 76 :193-199.)。对于GroEL重组蛋白的免疫保护性，目前尚无相关研究报道。布鲁氏菌GroEL 蛋白可参考文献 3 (Lin J.，Adams L. G.，Ficht T.A.Characterization of the heat shock response in Brucella abortus and isolation of the genes encoding the GroEL heat shock proteins. Infect Immun, 1992,60 :2425-2431.)的方法获得。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供布鲁氏菌GroEL蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的新应用。本专利技术另一目的在于提供了一种高效表达布鲁氏菌GroEL蛋白的方法。该方法是利用Gateway技术使GroEL基因在宿主细胞获得表达，具体包括以下步骤1)构建入门克隆(即BP反应)将GroEL基因和入门载体在(Gateway BP Clonase 酶的作用下进行反应，使GroEL基因克隆进入门载体中，得到入门克隆；2)构建表达克隆载体(即LR反应)将步骤1)构建的包含GroEL基因的入门克隆和目的载体在(Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应，使GroEL基因转移进目的载体，得到表达克隆载体；3)将步骤幻构建的表达克隆载体导入宿主细胞，经表达、纯化，得到高活性的布鲁氏菌保护性抗原GroEL。在上述布鲁氏菌保护性抗原GroEL的重组表达方法中，所述步骤1)中的GroEL基因可采用PCR的方法获得，具体包括以下步骤1)先以牛布鲁氏菌的基因组DNA为模板，用5’端含搭桥序列的引物 GroEL-E-F(序列表中序列1)和GroEL-E-R(序列表中序列2)扩增GroEL基因，目的是使 PCR扩增产物带上搭桥序列；2)再以步骤1)的PCR扩增产物为模板，在通用引物attBl(序列表中序列3)和 attB2(序列表中序列4)的引导下进行PCR扩增，目的是使GroEL的PCR扩增产物带上attB 序列，得到GroEL基因。所述步骤1)中的入门载体优选为PD0NR201 ；其中，以pD0NR201为入门载体构建的包含GroEL基因的入门克隆为pENTR-GroEL。所述步骤1)中的1 μ 1反应体系为目的基因扩增纯化产物(lOOng/μ 1)0. 5μ 1、 Gateway BP Clonase酶0· 2 μ 1、入门载体(50ng/μ 1) 0. 3 μ 1 ；反应条件为先在室温下反应4_6h，然后用0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下灭活Gateway BP Clonase酶。所述步骤2)中的目的载体优选为pHXGWA ；其中，以pHXGWA为目的载体构建的包含GroEL基因的表达克隆载体为pHXG-GroEL。所述步骤2)中的1 μ 1反应体系为包含GroEL基因的入门克隆(150ng/ μ 1)0. 5 μ 1、目的载体(lOOng/μ 1)0. 3μ 1、Gateway LR Clonase 酶 0· 2 μ 1 ；反应条件为 先在室温下反应4_6h，然后用0. 2μ 1蛋白酶K在37°C下灭活(Gateway BP Clonase酶。所述步骤幻中的宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体可为E. coli ER2566 (DE3)、E. coliBL21 (DE3)、 E.coli BL21(DE3，plysS)，E. coli JM109,E. coli HBlOl 或Ε. coli ToplO 等，优选为 Ε. coli ER2566(DE3)。所述步骤幻中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG 的浓度为0. 2-1. Ommol/L，优选为0. 5mmol/L，诱导温度为35-39°C，优选为37°C，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。所述步骤幻中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化，其中，用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为用4-6倍柱体积的细胞裂解液(50mmol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．布鲁氏菌ＧｒｏＥＬ蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉飞，陈泽良，黄留玉，付思美，徐杰，袁静，杜昕颖，汪舟佳，宋宏彬，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11
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