本发明专利技术的目的是提供一种微小核糖核酸(miRNA)或微小核糖核酸簇(miRNA簇)促进细胞形成诱导性多能干细胞而改变细胞命运的方法。方法包括如下步骤：步骤1、从供体基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因并获取供体细胞；步骤2、利用步骤1中的miRNA或miRNA簇将步骤1中供体细胞的细胞命运改变；步骤3、对步骤2中得到的细胞进行鉴定。与现有技术相比，miRNA或miRNA簇的利用，可以不使用癌基因c-myc来诱导干细胞，降低了潜在的致癌性，可以加速细胞命运的改变，同时获得了极高的诱导效率，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
我国是世界人口大国，每年因为创伤、疾病、衰老、以及遗传所导致的器官缺损、衰竭、功能障碍也居世界之首，以药物和手术治疗为基本支柱的经典医学治疗手段已不能满足临床医学的巨大需求，所以对干细胞与再生医学的研究受到了相当多科研单位以及社会各界的普遍重视。细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，特定类型的细胞细胞移植可能能被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而， 细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。为了解决细胞移植治疗面临的问题，细胞命运的转化受到越来越多科学家的重视。虽然细胞分化和命运的决定一直认为是发育过程中不可逆转而且是稳定的过程，而在体外，越来越多的证据表明，这一过程是可以被逆转的。对于细胞命运调节的研究还只是处于实验室研究状态，离临床实验还有很长的距离。这些通过转录因子过表达获得的转化的细胞还存在很多应用上的难题，比如说，病毒插入、潜在致瘤性、获得转分化细胞的纯度、在机体内能否弥补正常细胞发挥应有的功能等寸。2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从M个因子中筛选出0ct4、Sox2、C-myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠干细胞的培养条件下获得了多能干细胞，该细胞系而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠干细胞，故将其命名为诱导多能干细胞；同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了人的诱导多能干细胞。但导入C-myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%，会阻碍其未来的临床应用。Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染C-myc以外的其余3 个基因，在调整培养条件后也可得到ips细胞。去除C-myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成ips细胞的效率却明显降低。miRNA是一类小的非编码RNA，它参与调节细胞的生长、凋亡、个体的发育等生命过程。很多miRNA在干细胞的分化过程中，能够促进干细胞往某个特定的方向分化，比如说神经元、肌肉细胞、脂肪细胞等等。miRNA可以改变小鼠成纤维细胞向诱导多能干细胞重编程的效率，从而参与细胞命运的转化。而对于这类型的细胞命运改变，目前还很少研究。
技术实现思路
为提高诱导多能干细胞的效率，提高诱导多能干细胞的质量。本专利技术的目的是提供一种微小核糖核酸(miRNA)或微小核糖核酸簇(miRNA簇)促进细胞形成诱导性多能干细胞而改变细胞命运的方法。为实现该目的，采用如下技术方案，该方法包含以下步骤步骤1 从供体基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因并获取供体细胞，其中从基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因步骤如下步骤11 设计特异的miRNA或miRNA簇的引物；步骤12 通过聚合酶链式反应从供体基因组中扩增miRNA或miRNA簇基因，并通过分子克隆手段克隆到载体；步骤2 利用步骤1中的miRNA或miRNA簇将步骤1中分离出的供体细胞的细胞命运改变；步骤21 将miRNA或miRNA簇以及多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞；步骤22 采用相应的培养基对经过步骤21处理后得到的诱导多能干细胞进行培养；步骤23 将步骤22中出现的胚胎干细胞样克隆挑选出来，采用干细胞培养基培养。上述的多能干细胞诱导因子可以是任何来源的，优选小鼠的多能干细胞诱导因子及其变体，其中 0ct4，NCBI 登录号为 NM_013663 ；Sox2, NCBI 登录号为 NM_011443 ；Klf4, NCBI登录号为010637 ；c-Myc, NCBI登录号为NM_001177353 ；多能干细胞诱导因子并不限于以上列出的优选的因子，还可以包括现有技术中以及发现的具有诱导多能干细胞作用的任何诱导因子，如Soxl、Klf5、l-Myc或n-Myc、Esrrb, LRH等，也可以是其他具有该功能的编码或非编码RNA(包括micro RNA、长非编码RNA)、蛋白质、肽、化学物、细胞因子以及任何可能的组织培养基或培养环境(如低氧)。上述多能干细胞诱导因子导入细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、基因枪等。优选的，所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述 miRNA 或 miRNA 簇为选自由 miR-200b_429，miR-106a_363 和 miR-302_367 组成的组。优选的，所述miRNA或miRNA簇的基因载体为病毒载体、质粒载体、外随体载体、 mRNA载体或直接化学合成。优选的，所述病毒载体为逆转录病毒。优选的，步骤21所述的多能干细胞诱导因子包括0ct4、Sox2、Klf4、Soxl、Klf5、 I-Myc, n-Myc、Esrrb, LRH中的一种或几种，但不包括c_Myc。与现有技术相比，miRNA或 miRNA簇的利用，可以不使用癌基因c-myc来诱导干细胞，降低了潜在的致癌性，可以加速细胞命运的改变，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。优选的，步骤21所述的多能干细胞诱导因子包括0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc, Soxl、5Klf5、I-Myc、n-Myc、Esrrb、LRH 中的一种或几种。优选的，所述多能干细胞诱导因子为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码 RNA、蛋白质或肽。优选的，所述非编码RNA为miRNA或长非编码RNA。优选的，所述述多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞的方法为病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪。优选的，所述多能干细胞诱导因子导入方法为逆转录病毒感染。优选的，所述逆转录病毒为pMXs载体。优选的，所述步骤1还包括优选的，将步骤12得到的载体测序，验证基因的正确性，如果基因序列正确，进行步骤14，如果基因序列不正确，重新进行步骤11 ；步骤14 验证步骤13中载体的基因表达，如果表达正确，进行步骤2，如果表达不正确，重新进行步骤11。优选的，在步骤2之后进行步骤3 对步骤2中得到的诱导多能干细胞进行鉴定。优选的，所述供体为小鼠，所述供体细胞为小鼠胚胎纤维原细胞。优选的，所述供体为人类，所述供体细胞为人类胚胎纤维原细胞。附图说明图 Ia 为 miRNA cluster A、miRNA cluster B、miRNA cluster C 的信息；图Ib 为miRNA在基因组成簇分布的示意图以及克隆到载体后的表达量图示；图加为从小鼠胚胎分离的胚胎纤维原细胞的显微照片；图2b导入多能性因子以及miRNA或miRNA簇后的细胞命运改变的显微照片；图2c为最终形成的干细胞的显微照片；2c为细胞命运改变过程不同时间状态发展示意图；图3a标示了对照组处理之后的显微本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，该方法包含以下步骤：步骤１：从供体基因组中克隆ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇的基因并获取供体细胞，其中从供体基因组中克隆ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇的基因步骤如下：步骤１１：设计特异的ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇的引物；步骤１２：通过聚合酶链式反应从供体基因组中扩增ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇基因，并通过分子克隆手段克隆到基因载体；步骤２：利用步骤１中的ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇将步骤１中分离出的供体细胞的细胞命运改变；步骤２１：将ｍｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ簇以及多能干细胞诱导因子导入步骤１中的供体细胞；步骤２２：采用相应的培养基对经过步骤２１处理后得到的诱导多能干细胞进行培养；步骤２３：将步骤２２中出现的胚胎干细胞样克隆挑选出来，采用干细胞培养基培养。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，米格尔·安格尔·艾斯特班，鲍习琛，廖宝剑，张必良，阿塔那希奥斯·泽沃伊丽斯，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：81
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