猪气管上皮细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术公开了一种猪气管上皮细胞系的建立方法，包括以下步骤：(1)原代培养：无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37℃，5％CO2条件下培养；(2)转染和筛选：提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。本发明专利技术方法易于培养，生长速度较快，操作方法简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物动物细胞系领域，具体涉及。
技术介绍
气管上皮位于气管管腔内表面，属假复层纤毛柱状上皮，是机体对外防御有害物质侵扰的第一道屏障。其组成细胞——气管上皮细胞除具有机械防御作用之外，还可以合成和分泌多种粘液成分和细胞因子，用于调节气道上皮细胞生长、维持气管上皮完整性、湿润和净化呼吸道、抵抗多种病原菌对气管上皮的侵害，另外，气管上皮细胞还具有参与气道黏膜免疫反应、帮助消除气管炎症等重要作用。目前，尚无有关猪气管上皮细胞细胞系建立方法的研究出现，且以现有细胞系建立方法获取的永生化的猪血管内皮细胞，由于在筛选过程中获得单克隆阳性细胞较少，细胞生长的量也很少，且增殖缓慢，营养条件要求较高，生产成本高，不利于推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种易于培养，生长速度较快，操作方法简便的。本专利技术采用如下技术方案一种猪气管上皮细胞系的建立方法，包括以下步骤(1)原代培养无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12 培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养；(2)转染和筛选提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。所述的方法，所述步骤( 将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的猪气管上皮细胞，其具体步骤如下(1)转染前Mh，将STECs用蔗糖EDTA和0.25%胰酶分步消化成单个细胞，以 IXio5个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80% 90%的融合；(2)转染前4h更换无血清的DMEM/F12 ；(3)用无血清的DMEM/F12稀释5 μ LpCI-neo-hTERT质粒至体积为50 μ L，轻轻混勻，质粒浓度达到300ng/ μ L 400ng/ μ L室温作用5min ；(4)用无血清的 DMEM/F12 分别稀释 Lipofectamine 20006 μ L、9 μ L、12 μ L 到 50 μ L，轻轻混勻，室温作用5min ；(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100 μ L。轻轻混勻，室温作用20min ；(6)将12孔板中的旧培养液吸出，用D-Hank’ s清洗，加入900 μ L无血清的DMEM/ F12 ；(7)逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混勻；同时设立2孔未转染作为空白对照；(8)在37°C、体积分数比为5% CO2饱和湿度培养箱中孵育4 6h，弃去培养液， 加入完全的DMEM/F12培养基；(9)24h 48h观察细胞，并及时换液。所述的方法，所述步骤(3)的具体操作为(1)转染48h后待细胞汇合至80%时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液，连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况；(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400 μ g/mL ；(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止；(4)将阳性克隆用滤纸片法消化并转移至新12孔板，扩大培养。本专利技术还提供了按照上述方法建立的猪气管上皮细胞系。本专利技术采用脂质体转染法将人端粒酶逆转录酶基因转入正常的猪气管上皮细胞， 激活其端粒酶活性，以自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒，获得无限分裂和增殖的能力，建立了猪气管上皮细胞的永生化细胞系。附图说明图1原代培养传至第3代的细胞(X 100)电镜图。图2转染后第50代细胞(X100)电镜图。图3转染后第50代细胞(X 200)电镜图。图4转染前第3代和转染后第15代、35代永生化的STECs hTERTmRNA RT-PCR检测结果图。图5转染后永生化的STECs气管上皮细胞8型角蛋白免疫荧光检测(X400)电镜图。图6原代STECs和永生化的STECs生长曲线比较。图7原代第3代STECs细胞生长周期分布图。图8永生化的STECs第35代细胞生长周期分布图。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例11、无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞，形态呈圆球状，多单个存在，显微镜下可见纤毛摆动。2、将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养。6 他，细胞贴壁；24h左右，细胞呈单层贴壁生长；2 4d细胞铺满平皿底部。经 8型角蛋白间接免疫荧光鉴定，细胞核无特异性荧光，细胞膜有荧光，结合细胞形态观察，证实所分离培养的细胞为猪气管上皮细胞。3、提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法， 利用Lipofectamine 2000 Regent转染试剂盒将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒 pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪气管上皮细胞进行转染。4、转染4 后通过G418进行筛选，第2天细胞开始死亡，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，G418浓度降至一半维持筛选，继续筛选一个月左右，待发现抗G418阳性细胞克隆后，于37°C、5%的 CO2培养箱内扩大培养，利用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆纯化，获得单克隆的气管上皮细胞，并将其传代培养。5、RT-PCR技术在转染hTERT的细胞中均检测到hTERT mRNA在转染细胞中表达， 用抗hTERT单克隆抗体进行Western Blot检测，发现有特异性条带产生，而原代培养的细胞没有检测到。表明外源性hTERT基因可以在转染猪气管上皮细胞中表达，并激活猪气管上皮细胞的端粒酶活性。6、将阳性单克隆气管上皮细胞在体外于37°C、5%的(X)2培养箱内连续培养，单层细胞呈铺路石样，细胞间界限分明，存在接触抑制，具有正常细胞的增殖周期，培养超过80 代次，即得永生化的细胞系。本专利技术所述DMEM/F12培养基购自invitrogen公司，完全培养基是在原培养基中加入10%胎牛血清。本专利技术所述的无血清DMEM/F12培养液是不加10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。实施例3上述阳性细胞的筛选过程和转染细胞的纯化过程，具体步骤如下1、G418筛选及阳性细胞的获得(1)转染48h后待细胞汇合至80%时，将细胞传代消化到另一个12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418进行筛选，第7天时，可用胰酶于原皿消化细胞，弃去消化液并补加筛选液(完全DF12培养基加G418)。连续培养两周，每两天换相同浓度G418筛选液1次，每天观察细胞生长及死亡情况。(2)待对照孔的细胞全部死亡后，将G418的浓度减半，降至400 μ g/mL。(3)继续筛选细胞一个月左右，每两天换1次液，直到阳性克隆可见为止。(4)将阳性克隆用滤纸片法消本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪气管上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）原代培养：无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于ＤＦ１２培养基中，置于３７℃，５％ＣＯ２条件下培养；（２）转染和筛选：提取纯化含有ｈＴＥＲＴ基因的真核表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ－ｈＴＥＲＴ，采用脂质体转染法，将编码ｈＴＥＲＴ和ｎｅｏ基因的真核表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ－ｈＴＥＲＴ导入步骤（１）原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；（３）筛选和扩大培养。

【技术特征摘要】
1.一种猪气管上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(1)原代培养无菌获取初生仔猪气管，清除粘附组织，采用链酶蛋白酶灌注冷消化法消化分离获得高纯度的气管上皮细胞；将分离得到的原代气管上皮细胞悬浮于DF12培养基中，置于37°C，5% CO2条件下培养；(2)转染和筛选提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的猪气管上皮细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤( 将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的猪气管上皮细胞，其具体步骤如下(1)转染前Mh，将STECs用蔗糖EDTA和0.25 %胰酶分步消化成单个细胞，以1 X IO5 个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80% 90%的融合；(2)转染前4h更换无血清的DMEM/F12；(3)用无血清的DMEM/F12稀释5μ L pCI-neo-hTERT质粒至体积为50 μ L，轻轻混勻， 质粒浓度达到300ng/ μ L 400ng/ μ L室温作用5min ；(4)用无血清的DMEM/F12 分别稀释 Lipofectamine 2000 6 μ L、9 μ L、12 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，
申请(专利权)人：张彦明，陈宝玉，
类型：发明
国别省市：87