用于候选病毒疫苗的无血清病毒繁殖平台制造技术

本发明专利技术涉及用于繁殖病毒的方法。本发明专利技术尤其提供了用于繁殖病毒的优化条件。提供了以下参数的优化：作为培养基补充物的脂质浓缩物、从感染前到感染后的温度转换、感染复数、直接珠－珠转移以及感染前培养基的血清补充。具体地说，本发明专利技术首次提供了通过在含有化学上明确的脂质浓缩物（ＣＤＬＣ）的培养基中培养受病毒感染细胞来繁殖病毒的方法。在另一项权利要求中，在基本无血清的培养基中添加所述ＣＤＬＣ用于病毒感染细胞的培养。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1.引言本专利技术涉及用于繁殖病毒的方法。具体地说，本专利技术提供了用于繁殖病毒的最优化条件。提供了以下最优化参数：作为培养基补充物的脂质浓缩物，从感染前到感染后的温度转换，感染复数和感染前培养基的血清补充。具体地说，本专利技术首次提供了用于繁殖病毒的通过在含有化学上明确的脂质浓缩物(CDLC)的培养基中培养受病毒感染细胞的方法。在另一种实施方式中，在基本不含血清的培养基中添加所述CDLC用于病毒感染细胞的培养。在另一种实施方式中，本专利技术提供了通过直接的珠—珠转移方法繁殖含病毒细胞培养物。2.专利技术背景1-3型人副流感病毒(hPIV1-3)以及呼吸道合胞病毒(RSV)和人偏肺病毒(hMPV)是副粘病毒家族的非片段化负链RNA病毒。副粘病毒科在单股反链病毒目中形成一个家族，它包括副粘病毒和肺炎病毒两个亚家族。副流感病毒是副粘病毒科家族呼吸道病毒属(PIV1、PIV2和PIV3)的一个成员。人呼吸道合胞病毒(hRSV)是肺炎病毒属的一个种，并且是全球范围内引发幼年期和儿童早期下呼吸道感染最重要的单一原因(Domachowske和Rosenberg，1999，Clin Microbio Rev 12(2)：298-309)。HMPV是副粘病毒家族的新成员，其临床症状类似于由hRSV感染引发的症状，从轻度上呼吸道疾病至急性细支气管炎和肺炎不等(Van Den Hoogen等，2001，Nature Medicine 7：719-724)。van den Hoogen等人(van den Hoogen等，2002，Virology 295：119-132)对人偏肺病毒的基因组构造进行了描述。总体而言，hPIV3和RSV以及hMPV被认为是所有导致住院治疗的儿科呼吸疾病病例中约三分之一病例的病因(Hall，2001，N Eng J Med 344：1917-1927)。2.1 PIV感染-->副流感病毒感染(PIV)导致婴儿和儿童中严重的呼吸道疾病(Tao等，1999，Vaccine 17：1100-08)。传染性副流感病毒感染占到全球遭受呼吸道感染的儿科患者所有住院治疗病例的约20％。同上。PIV由两个结构模块构成：(1)含病毒基因组的内部脱氧核糖蛋白质核心或核衣壳，以及(2)外部的近似球形的脂蛋白包膜。其基因组是单链的反义RNA，长度约为15,456个核苷酸，编码至少8种多肽。这些蛋白质包括但不限于核衣壳结构蛋白(根据属的不同分别为NP、NC或N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)、大聚合酶蛋白(L)和未知功能的C和D蛋白。同上。副流感病毒核衣壳蛋白(NP、NC或N)在每个蛋白单位内包含两个结构域，这包括构成整个分子约三分之二、与RNA直接相互作用的氨基端结构域，以及位于所装配的核衣壳表面的羧基端结构域。认为在这两个结构域的接合处存在着铰链结构从而赋予该蛋白一定程度的柔韧性(参见Fields等主编，1991，Fundamental Virology(基础病毒学)，第2版，莱文出版社(Raven Press)，纽约，通过参考完整地整合在本说明书中)。基质蛋白(M)显然参与病毒装配并与病毒膜以及核衣壳蛋白相互作用。经受磷酸化的磷蛋白(P)被认为在转录中起调节作用，并且可能参与甲基化、磷酸化以及聚腺苷化。融合糖蛋白(F)与病毒膜相互作用，并且首先形成无活性的前体形式，随后在翻译后裂解产生两个由二硫键连接的多肽。通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，活性F蛋白也参与副流感病毒穿越进入宿主细胞。同上。血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)从包膜突出，使得病毒具有血凝素和神经氨酸酶活性。HN在其氨基端是强疏水性的，其功能在于将HN蛋白锚定在脂质双层中。同上。最后，大聚合酶蛋白(L)在转录和复制中发挥重要作用。同上。2.2 RSV感染呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿和儿童中严重的下呼吸道疾病的主要原因(Feigen等主编，1987，Textbook ofPediatric Infectious Diseases(儿科传染病手册)，WBS出版社(WB Saunders)，费城，1653-1675页；New Vaccine Development，Establishing Priorities(新疫苗开发)，第1卷，1985，国立学院出版社(National-->Academy Press)，华盛顿特区，397-409页；以及Ruuskanen等，1993，Curr ProblPediatr 23：50-79)。全球RSV每年的流行病特征是明显的，但在特定季节中RSV疾病的影响范围和严重程度随地域而不同(Hall，1993，Contemp Pediatr10：92-110)。在北半球的温带地区，疾病通常始于晚秋并结束于晚春。原发RSV感染最常见于6周至2岁的儿童，并在医院流行病过程中罕见于4周内的新生儿(Hall等，1979，New Engl J Med 300：393-396)。RSV感染高风险的儿童包括但不限于早产儿(Hall等，1979，New Engl J Med 300：393-396)以及患有支气管肺发育不良(Groothuis等，1988，Pediatrics 82：199-203)、先天性心脏病(MacDonald等，New Engl J Med 307：397-400)、先天性或获得性免疫缺陷(Ogra等，1988，Pediatr Infect Dis J 7：246-249；以及Pohl等，1992，J Infect Dis165：166-169)和囊性纤维化(Abman等，1988，J Pediatr 113：826-830)的儿童。因RSV感染而住院治疗的患心脏或肺部疾病的幼儿中的死亡率是3％-4％(Navas等，1992，J Pediatr 121：348-354)。RSV感染成人以及婴儿和儿童。在健康成人中，RSV主要引起上呼吸道疾病。最近的研究显示，某些成年人(尤其是老人)具有症状性RSV感染的情况比以往所报道的要常见的多(Evans，A.S.主编，1989，Viral Infections ofHumans.Epidemiology and Control(人的病毒感染，流行病学和控制)，第3版，普理门医学出版社(Plenum Medical Book)，纽约，525-544页)。在在家看护的患者和专门机构照料下的年轻人中也已报道了一些流行病例(Falsey，A.R.，1991，Infect Contro本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｖｅｒｏ细胞培养物，其包含在一种基本无血清的细胞培养基中的被病毒感染的Ｖｅｒｏ细胞，其中所述培养物产生至少为７．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ的病毒滴度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-10-23 60/862,550;US 2007-4-5 PCT/US2007/061.一种Vero细胞培养物，其包含在一种基本无血清的细胞培养基中的被病
毒感染的Vero细胞，其中所述培养物产生至少为7.0log10TCID50/ml的病毒滴
度。
2.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述细胞培养基包含浓度为
约0.5至约2.5g/L的葡萄糖。
3.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述细胞培养基包含浓度为
约1.0至约2.0g/L的乳酸。
4.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述细胞培养基包含浓度为
约2.0至约4.0g/L的谷氨酰胺。
5.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述细胞培养基包含浓度为
约1.25至约2.5mM的铵离子。
6.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述培养物产生至少为8.0
log10TCID50/ml的病毒滴度。
7.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述病毒是负链RNA病毒。
8.如权利要求7所述的培养物，其特征在于，所述负链RNA病毒是不分
节段的。
9.如权利要求8所述的培养物，其特征在于，所述病毒是副粘病毒。
10.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述副粘病毒是重组副流
感病毒或重组呼吸道合胞病毒或重组偏肺病毒。
11.如权利要求10所述的培养物，其特征在于，所述副流感病毒是牛副流
感病毒。
12.如权利要求11所述的培养物，其特征在于，所述牛副流感病毒进一步
包含一个或更多个人副流感病毒核苷酸序列。
13.如权利要求10所述的培养物，其特征在于，所述重组副流感病毒进一
步包含呼吸道合胞病毒的核苷酸序列。
14.一种用于在Vero细胞中繁殖病毒的方法，所述方法包括：
a.在第一温度下在生物反应器中培养Vero细胞，这包括用Vero细胞接种
含化学上明确的脂质浓缩物(CDLC)和微载体的细胞培养基；
b.以约0.001至约0.10的感染复数在第二温度下感染步骤(a)中所培养
的Vero细胞，其中所述第二温度低于所述第一温度；以及
c.从步骤(c)的细胞培养物中回收病毒，其中所述所回收的病毒具有至少
为7.0log10TCID50/ml的病毒滴度。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述生物反应器是一种单次
使用生物反应器(SUB)系统。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述SUB是一种搅拌釜反
应器系统。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基是一种无血
清培养基。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述CDLC添加至1％的浓
度(体积比)。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基是选自
OptiPROTM SFM、VP-SFM、SFM4MegaVirTM、Ex-Cell VeroTM或WME的无血
清培养基。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述化学上明确的脂质浓缩
物包括普流罗尼F-68、乙醇、胆固醇、吐温80、DL-α-生育酚醋酸酯、硬脂酸、
十四烷酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸以及亚麻酸中的一
种或多种。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述化学上明确的脂质浓缩
物包括普流罗尼F-68、乙醇、胆固醇、吐温80、DL-α-生育酚醋酸酯、硬脂酸、
十四烷酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸以及亚麻酸。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述化学上明确的脂质浓缩
物包含100,000mg/mL普流罗尼F-68、100,00mg/mL乙醇、220mg/mL胆固醇、
2,200mg/mL吐温80、7...

【专利技术属性】
技术研发人员：I尤克，W曾，M苏吉，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]