本发明专利技术公开了生产高纯度头孢霉素的基因工程菌及其应用。本发明专利技术所提供的基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。将所得到的的基因工程菌中的一株命名为顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium?chrysogenum)，其保藏号为CGMCC?No.4515。本发明专利技术将带有顶头孢霉菌启动子PpcbC的棒状链霉菌来源的基因cefF转入顶头孢霉菌中，使其在体内转录表达，增强DAOC羟化生成DAC这一催化反应，从而降低DAOC在终产物CPC中的含量，达到提高工业产品纯度的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程菌及其应用，特别涉及生产高纯度头孢菌素C的基因工程菌及其应用。
技术介绍
头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)是工业生产头孢菌素的原料，头孢菌素属于β内酰胺类抗生素，是一类具有重要应用价值的广谱抗生素。头孢菌素C的工业生产菌是顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。头孢菌素C在顶头孢霉菌中的生物合成途径已经研究得十分清楚，为利用基因工程手段改造顶头孢霉菌奠定了良好基础。去乙酰氧头孢菌素C(Deacetoxycephalosporin C，DAOC)是头孢菌素C生物合成过程中的一种中间产物。在生物合成中，青霉素N(penicillin N)被由基因cefEF编码的扩环/羟化双功能酶催化，首先扩环生成DAOC，然后羟化生成DAC(Deacetylcephalosporin C)。在工业发酵生产过程当中，DAOC会累积在发酵液中，占终产物CPC总量的1％到2％之间。当CPC作为原料进入下游化学合成头孢菌素的过程中，DAOC也会相应的变成无法去除的杂质，影响到产品的纯度。蛋白cefF的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。本专利技术的另一个目的是提供一种基因工程菌。本专利技术所提供的基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述宿主菌为顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；所述融合基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。所述重组表达载体为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述基因工程菌在生产头孢菌素C中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的又一个目的是提供含有如下融合基因的重组质粒：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。所述重组质粒为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重-->组表达载体；所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。蛋白cefF或蛋白cefF的编码基因在用发酵菌制备头孢菌素C的过程中降低产物中去乙酰氧头孢菌素C的产量中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。本专利技术的又一个目的是提供一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：发酵所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述工程菌，得到头孢菌素C。本专利技术将带有顶头孢霉菌启动子PpcbC的棒状链霉菌来源的基因cefF转入顶头孢霉菌中，使其在体内转录表达，增强DAOC羟化生成DAC这一催化反应，从而降低发酵产物中DAOC的量，达到提高工业产品CPC纯度的目的。附图说明图1为PCR扩增PpcbC产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为PCR扩增cefF产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3为重组质粒pAg1-H3-cefF的构建。图4为PCR验证基因工程菌株的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图5为野生型菌株中DAOC与CPC的检测结果图。图6为基因工程菌株中DAOC与CPC的检测结果图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、生产高纯度头孢霉素的基因工程菌及其应用顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CGMCC 3.3795购自中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)；棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC27064购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。一、构建重组质粒pAg-H3-cefF1、PCR扩增启动子PpcbC以顶头孢霉(Acrernonium chrysogenum)CGMCC 3.3795基因组DNA为模板，对基因pcbC的启动子区设计引物对：上游引物为：5′-GactagtGTGGATGGCACCTTTTGGG-3′，小写字母为酶切位点SpeI，下游引物为：5′-CggcgcgccGGTGACGGTTTGTCCTGCC-3′，小写字母为酶切位点AscI。PCR扩增得到1188bps大小DNA片段，使用SpeI和AscI双酶切，回收1.1kb片段，-->如图1(图1中泳道1为DNA marker，泳道2为PpcbC的PCR扩增产物)所示；并将所得到的PCR产物连接到克隆载体pEASY-Blunt(购自全式金公司)上进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段的核苷酸序列与启动子PpcbC基因序列(genebank号为X74601.1)一致，即序列表中序列1中第7-1194位核苷酸。2、PCR扩增基因cefF以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC27064基因组DNA为模板，对基因cefF设计引物对：上游引物：5′-AggcgcgccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3′，小写字母为酶切位点AscI，下游引物：5′-CcctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3′，小写字母为酶切位点SbfI。PCR扩增得到1091bps大小DNA片段，使用AscI和SbfI双酶切，回收1kb片段，如图2(图2中泳道1为DNA marker，泳道2为cefF的PCR扩增产物)所示；并将所得到的PCR产物连接到克隆载体pEASY-Blunt(购自全式金公司)上进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段的核苷酸序列为cefF基因序列，即序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸。该基因编码的蛋白序列如序列表中序列2所示。3、构建重组质粒pAg-H3-cefF使用SpeI和SbfI双酶切质粒pAg1-H3(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该质粒的非专利文献是：A.Zhang et al.Efficient disruption of a polyketide synthase gene(pksl)for melanin synthesis through Agrobacterium-mediated transformation of Glarea lozoyensis Mol Gen Genomic(2003)268：645-655)，回收6.4kb DNA片段，与上述两条DNA回收片段连接，方法是：将回收6.4kb的质粒DNA片段与步骤1回收的1.1kb启动子PpcbC片段以及步骤2回收的cefF基因1kb片段加入同一连接体系，使用T4DNALigase(NEB cat#M0202S)，16摄氏度反应，得到重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．顶头孢霉ｃｅｆＦ基因工程菌（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ），其保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５１５。
【技术特征摘要】
1.顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。2.一种基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述宿主菌为顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；所述融合基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。4.根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于：所述重组表达载体为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。5.权利要求1所述的顶头孢霉cefF基因工程菌或权利要求2-4中任一所述的基因工程菌在生产...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘钢，安洋，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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