一种基因组重排木霉菌及其制备及其应用制造技术

一种基因组重排木霉菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．２３６０。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种产纤维素酶髙及降解玉米秸秆效果好的木霉菌 基因组重排菌株、重排菌株的制备方法、固体发酵产酶的条件优化及该菌株降解玉米秸秆。
技术介绍
纤维素(cellulose)是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物。同时，它也是地球上 最丰富、最廉价的再生资源，纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的三分之--至二分之一，广泛而大量地存在于自然界中，是地球上最为丰富的可再生的生物聚合物之 一。有资料表明，全世界每年的植物体生成量达1500亿吨千物质，其中纤维素及半纤维素 的总量为850亿吨。经过长期的研究，人们发现能够降解和利用变性纤维素(如磷酸膨胀纤维素)，纤维素 衍生物(如梭甲基纤维素)的微生物种类繁多，在真细菌、放线菌、部分酵母和高等真菌等 很多主要的微生物类群中都有发现。但是，能合成组分齐全的纤维素酶体系，并向外分泌， 水解天然纤维素材料的种类则相对有限，许多种细菌、放线菌以及担子菌可在天然纤维素 材料上生成，有很强的分解纤维素的能力，但胞外纤维素酶活往往很低，而多数纤维素降 解真菌，特别是霉菌产生的纤维素酶都能分泌于体外。目前多数纤维素酶的研究都集中在 胞外酶活较高的木霉属(Tri choderma)的几个种粉状侧孢(Sporitrichum palverulentum)，腐皮镰孢(Fusarium solani)，绳状青霉(Pencillium funiculosum)， 曲霉属(/1we/^i7:丄"s)，青霉属(尸朋i'c"""/7 )和枝顶孢霉(力ci"e卿/ i'，)等霉菌和木腐菌菌株上。其中尤以木霉属的产量居多，木霉(7>i'c/ 00^7^ )属于半知菌亚门、丝孢 纲、丝孢目、粘孢菌类，是一类普遍存在的丝状真菌。霉菌是线状的，对纤维素纤维的降 解集中在纤维的端部，并不断生长，由内向外消化纤维素，使其逐渐被分解破坏。里氏木 雾(7>ic/70ofe/777a i-ee5e/)、康氏木霄(7>/c/ oc/e/m3 /rcw// g7'/)禾口纟录色木霄(rr/c/wtfermfl w'/7'ofe)等是木霉属中产纤维素酶活性较高的菌种，特别是绿色木霉(7Wc/wt/e/77ia "r"d 及其近缘的菌株，能产生三类纤维素酶，所产生的纤维素酶能分泌到菌体外， 一般不聚集 形成多酶复合体，但相互发生强烈的协同作用，破坏植物细胞壁，将植物纤维素分解为葡 萄糖。Genome shuffling技术是在传统诱变基础上，通过细胞融合技术，对诱变后的微生物 细胞进行基因组重组，从而使具有正向突变的菌株将其优点结合在一起，进而提高微生物 细胞的正向突变频率及正向突变速度。随着DNA改组等定向进化技术的发展，在90年代 初美国加州的Maxgen公司Ste國er等人提出的Genome shuffling技术的概念，这种技 术是分子定向进化在全基因组水平上的延伸.它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因 组，因此，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合.进行基因组重排首 先需要有一个含有各种不同正突变的基因组库(例如通过经典的诱变育种得到目的性状 发生改进的不同的正突变菌株就构成了所需的基因组库).随后通过原生质体融合将这些 正突变菌株的全基因组进行随机重组，并筛选目的性状得到进一歩改进的菌株来进行下----轮基因组重排，这样，通过循环多轮的随机重组可以快速、高效地选育出表型得到较大改 进的杂交菌种.其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱变，然后在模拟DNA重组的条件 下对原生质体进行递推式多次融合(recursive protoplast),最后筛选出具有多重正向进化标记的目标菌株。具体做法如下在采用递推式原生质体融合对目标菌株进行融合的 过程中，诱变，首先要进行原生质体的制备，然后模拟DNA改组的反应温度条件对原生质 体进行融合，然后在非选择条件下再生；再生原生质体菌丝混合就构成了 FL; Fl长成菌 落，长出的菌落再被制备成为原生质体，同时用同样的方法再进行融合再生，这一过程重 复三、四次得到后代菌落；与对照相比，融合后代有效率达到60%、 17%、 2.5%,较之未融 合前增加了 40-105倍。这一过程中操作的方法与原生质体融合技术基本相同。例如，在 Ying-Xin Zhang等人的研究中，以四株营养缺陷型的弗氏链霉菌为模型进行链霉菌之间的 重组，实验表明采用的原生质体融合是实现基因组重组的十分有效的办法，重组有效率超 过20%。检测四株经多营养缺陷型的链霉菌的原生质体重组的后代发现，重组中含有两个 标记的重组后代为3%,含有三个标记的为0.04%,四个标记为0.00005%。在这一过程中， 我们可以看到，后代中带有多重正向进化标记重组子出现的几率是采用原始诱变育种方法 的40-105倍。这一结果将为多基因重组提供有效依据，使得我们可以通过DNA改组，，获 得含有多个亲本遗传信息的更有意义的子代。采用表型的筛选法，可以直接对已知或未知 的代谢途径进行快速优化、构建新的代谢途径用于合成新化合物或降解毒害物质，极大地 促进了代谢工程的进一步发展和应用。其优化范围从单个蛋白，整个代谢途径或前体供应 途径，到整个基因组。Genome shuffling可以利用重组DNA技术对细胞的多种不同基因组 进行定点改造和修饰，增加多基因重组的几率，可以得到各种改造后的细胞组成多样性的 基因组库，然后通过循环的基因组重排，筛选集多个改造基因于一体的细胞，这样可以极 大地加快工程菌株的构建进程，减少对菌株进行多个基因改造和组合的困难，并明确重组 优化的原因或本质。基因组重排已经被证明是一种有效的、新颖的全细胞的进化方式，可以快速提高工业微生物的表型。这是在传统育种、原生质体融合育种以及基因工程育种的 基础上对微生物育种技术的一次革命性的改进。原始菌株一绿色木霉和康宁木霉购自中科院微生物研究所，可以发酵产纤维素酶，但 是这两种木霉菌产酶能力有限，还不能达到工业生产的要求，通过传统的诱变方法提高产 酶能力的幅度不大，而基因工程的方法又不能克隆齐全的纤维素酶系。
技术实现思路
-本专利技术提供一种基因组重排木霉菌及其制备及其应用。通过基因组重排技术手段，以解决原 始菌株一绿色木霉产酶能力有限、不能达到工业生产要求的问题。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC Nu. 2360。保藏H期 2008丄24,分类命名木霉。本专利技术所提供一种上述基因组重排木霉菌的制备方法包括下列歩骤(一) 将原始菌株绿色木霉AS3.3711和康宁木霉，分别采用PDA培养基进行纯化， 并进行形态学观察，挑取生长较旺盛的菌落进行刚果红培养基平板及固体发酵培养，测定 纤维素酶活；(二) 基因组重排-(1)原生质体制备与再生将纯化后生长最旺盛产酶最高的绿色木霉AS3.3711和康 宁木霉的孢子在水中稀释至呈浅绿色，为(1~5) Xi0'个孢子，mr，将孢子悬浮液lml 加入到盛有10Gml液体菌丝培养基的三角瓶中，瓶放到摇床中，振荡培养，条件为28-30 'C, 200r/min， 20-24h,在无菌条件下，将无菌条件下培养的菌丝经4层无菌擦镜纸过滤，用无菌水冲洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组重排木霉菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２３６０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王丕武，张发福，付永平，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：82