根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种日本曲霉菌株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）。该日本曲霉菌株甘油氧化酶产量比原始菌株提高５０％。该菌株利用根癌农杆菌介导的转化方法获得。包括将适合丝状真菌转化的载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，将含有载体的根癌农杆菌和日本曲霉分生孢子混合培养，以潮霉素Ｂ作为选择压力筛选出日本曲霉的转化子。本方法操作简单，重复性好，转化率高，１０６个孢子可以得到超过８０个转化子。本方法为日本曲霉功能基因的研究，以及日本曲霉工程菌的分子育种奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种高产甘油氧化酶的日 本曲霉菌株以及根癌农杆菌介导的日本曲霉转化方法。
技术介绍
曲霉属包括灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)群、白曲霉 (Aspergillus candidus)群、黄曲霉(Aspergillus flavus)群、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)群、烟曲霉(Aspergi 1 lusfumigatus)群、掠曲霉(Aspergillus ochraceus) 群、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)群、黑曲霉(Aspergillus niger)群等等。其中黑曲 霉群中的很多种，如黑曲霉(Aspergillus niger)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，泡盛 曲霉(Aspergillus awamori)等都具有强大的酶系统，目前已经广泛应用于工业大规模生 产各种生物酶制剂，包括淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、 脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶等。黑曲霉群的发酵工艺已经十分成熟。实际人们对于这些酶还没有充分利用，所受到的主要限制之一就是，产生的某些 酶酶活太低而没有实用价值。目前，很多研究者已经分别采取物理、化学诱变、原生质体融 合以及分子生物学手段来对菌种进行改良，以期得到具有优良产量性状的菌株。日本曲霉(Aspergillus japonicus)属于半知菌纲，从梗孢目，从梗孢科，曲霉属 的黑曲霉群，分布十分广泛，可以在棕桐油、空气、土壤中分离得到。其菌落生长较快，10天 直径就可达5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色，后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老 后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形或稍长，小梗单层，分生孢子球形或 近球形，有明显的小刺。有些菌系产生白色或奶油色的球形菌核，是黑曲霉群中单层小梗的 代表类型。目前发现日本曲霉可以产生甘油氧化酶GL0X，并且日本曲霉产生甘油氧化酶的活 力最高，虽然青霉中也可以产生GL0X，但是产生的GLOX结合在菌丝体细胞的表面，难于分 离，且很不稳定，不适合生产的需要。所以日本曲霉有作为工程菌株生产甘油氧化酶的潜 力，但日本曲霉的基因组序列尚未测通，其中与甘油氧化酶代谢相关的基因目前也还未知， 并且甘油氧化酶的产量也相对较低，所以需要建立一套有效的遗传转化体系，这样不仅可 以为日本曲霉功能基因的分子生物学研究提供前提，也可以为日本曲霉优良性状菌株的育 种提供手段，同时也为曲霉属其他的种提供分子生物学研究方法。根癌农杆菌介导法首先应用于植物的遗传转化，并由Bimdock首先应用于酿酒酵 母的遗传转化，之后在丝状真菌中得到了广泛的应用，为丝状真菌的研究奠定了基础。但目 前对于日本曲霉还没有根癌农杆菌介导的遗传转化体系的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高产甘油氧化酶的日本曲霉菌株。本专利技术 的另一目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种根癌农杆菌介导的日本曲霉的转化 方法及甘油氧化酶高产菌株的筛选。本专利技术提供的日本曲霉菌株(Aspergillus japonicus)Ajyz0079，属于真菌界 (Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，半知菌纲(Sphaeropsidales)，从梗孢目(Moniliales)， 从梗孢科(Moniliaceae)，曲霉属(Aspergillus)。其菌落生长较快，10天直径就可以达到 5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形活稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显 的小刺。本专利技术提供的，包括以 下步骤第一、将载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，其中所述的载体质粒为 pBI-hphll，含有构巢曲霉启动子PtrpC和相应的终止子TtrpC，在启动子的下游含有潮霉 素B抗性基因；第二、将上步得到的含有载体质粒的根癌农杆菌和日本曲霉混合培养于含有诱导 剂乙酰丁香酮的IM固体培养基上的微孔滤膜上，培养3天后，转移到含有潮霉素B和头孢 霉素的察氏培养基中30°C培养得到潜在的转化子；第三、将第二步得到的潜在的转化子在不含抗生素的培养基上传代后，再于含有 潮霉素B和头孢霉素的培养基中培养，得到抗性遗传稳定的转化子。第四、提取第三步得到的转化子的基因组，以潮霉素B抗性基因的特异性引物检 测转化子的阳性，并以该抗性基因作为探针检测抗性基因的插入拷贝数。其中，第二步所述的日本曲霉为分生孢子；分生孢子的浓度为104、105、IO6UO7或 IO8 个 /mLo第二步和第三步中所述的潮霉素B的浓度为10μ g/mL 60μ g/mL，头孢霉素浓度 为 200 μ g/mL。采用本专利技术方法转化得到甘油氧化酶产量提高的转化子，并从中得到了一株甘油 氧化酶产量比原始菌株提高50%的菌株，命名为Ajyz0079。本专利技术方法的优点和积极效果(1)本专利技术建立了日本曲霉的一种遗传转化方法；(2)这种转化方法操作简单，重复性好。(3)所用的材料简单，只需要日本曲霉的分生孢子即可。(4)方便的得到日本曲霉转化子，为日本曲霉功能基因的分子生物学研究和优良 性状菌株的育种奠定了基础。具体实施方式实施例1 本专利技术实施例中涉及的培养基及试剂等分别为培养基土豆培养基20%土豆，2%葡萄糖，0. 3% ΚΗ2Ρ04，0· 15% MgSO4 · 7H20，PH 自然。LB 培养基蛋白胨，0. 5%酵母粉，NaCL，PH = 7.2-7.4。YEB 培养基0· 5 % 蛋白胨，0. 1 % 酵母粉，0. 05 % MgSO4 · 7H20，0. 5 % 蔗糖，PH = 7. 2。察氏培养基0.3 % NaNO3,0. 05 % KCL, 0. 1 % K2HPO4,0. 001 % FeSO4,0. 05 % MgSO4 · 7H20，3%蔗糖，PH = 7. 2-7. 4。20XAB Buffer 6% K2HPO4, 2% NaH2PO4, PH = 7. 0。20XAB Salt 2% NH4CL,0. 6% MgSO4 ·7Η20，0· 3% KCL,0. 02% CaCL2,0. 002FeS04,PH = 7. 0。MM 培养基5% 20XAB Buffer, 5% 20XAB Salt，0. 5%葡萄糖。IM 培养基2mmol/LN￡i3P04，50mmol/L MES，5% 20XAB Salt，0. 5%葡萄糖，PH = 5. 8。发酵培养基甘油4%，蛋白胨 lg/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，KH2PO4 lg/L，玉米浆 2g/ L，酵母膏3g/L。试剂硼砂碳酸钠缓冲液硼砂10. 36g/L，Na2CO3 4. 38g/L，EDTA 1. 46g/L。甘油氧化酶检测体系0. lmol/L甘油167μ L，0. 3mol/L PBS缓冲液 (pH7. 0)167yL,2. 4mol/L 4-氨基安替比林 167 μ L，42mmol/L 苯酚 167 μ L，过氧化物酶 (比活大于250) 33 μ L，去离子水267 μ L。步骤1 日本曲霉野生型菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种日本曲霉菌株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）Ａｊｙｚ００７９，属于真菌界（Ｆｕｎｇｉ），子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ），半知菌纲（Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｄａｌｅｓ），从梗孢目（Ｍｏｎｉｌｉａｌｅｓ），从梗孢科（Ｍｏｎｉｌｉａｃｅａｅ），曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；其菌落生长较快，１０天直径就能够达到５－６厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色后变为淡紫褐色；分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形或稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明春，魏东盛，杨哲，郭慧，邢来君，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12