本发明专利技术提供一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导多能干细胞的方法，用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三~第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，从儿童包皮成纤维细胞获得人iPSCs，经扩增培养，接种到滋养层细胞，诱导多能干细胞。本发明专利技术使用人骨髓间充质干细胞代替传统方法中用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了人iPSCs的生物学特性和多潜能性，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。
Method for culturing multipotent stem cells by human mesenchymal stem cells as feeder layer
The present invention provides a bone marrow mesenchymal stem cells as trophoblast cultured human induced pluripotent stem cells with human, with the subculture and cryopreservation resuscitation after cultured third ~ fifth generations of human bone marrow mesenchymal stem cells as trophoblast cells from foreskin fibroblast cells obtained by iPSCs amplification culture was inoculated into trophoblast cells, induced pluripotent stem cells. The invention of human bone marrow mesenchymal stem cells to replace the traditional method by using mouse embryo fibroblasts as cultured human trophoblast cells, induced pluripotent stem cells, reduce the heterologous cell system in the pollution of culture, and it is proved that the training system can make human induced pluripotent stem cells in vitro, and the long-term maintenance of biological characteristics iPSCs and pluripotency, pluripotent stem cells into clinical application provides the possibility for human induced.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种以人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养诱导多能干细胞的方法。
技术介绍
诱导多能干细胞anduced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。其是通过异位表达几个与维持胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)多潜能性相关的关键性核转录因子，使体细胞发生重编程，得到的一种类似ESCs的多潜能细胞，可以在体内外分化为三胚层的所有组织细胞。由体细胞重编程而来的iPSCs为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径，且不再使用人类早期胚胎和卵母细胞，故伦理学的争论将随之平息，核移植技术缺乏卵母细胞和技术繁杂的窘境也得到了合理的解决。是组织工程和再生医学、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞，因此具有广阔的临床应用背景。目前，研究者已在体外将人iPSCs向各种组织细胞诱导分化，如造血干/祖细胞、红细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、胰岛β细胞、肝脏细胞等； 建立了多种遗传性疾病人iPSCs疾病模型，用于发病机制的研究，并在动物模型上尝试通过对有遗传缺陷的iPSCs进行基因改造，治疗遗传性疾病；建立多种肿瘤iPSCs疾病模型， 用于发病机制的研究和药物筛选。人iPSCs的体外培养需要细胞与细胞的相互作用、各种细胞因子、基质等来维持其自我更新和多潜能性。其经典培养模式是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic fibroblasts, MEF)为滋养层，用含bFGF、血清替代物(serum replacement, SR)的培养液培养。但是，人iPSCs进入临床应用前，去除培养体系中异源蛋白、细胞污染是必须解决的一个问题。因此，自人iPSCs出现以后，研究者就开始尝试改善其培养体系，在维持其自我更新和多潜能性的同时，减少异源蛋白、细胞的污染。如2010年，Christian等用永生化的人皮肤成纤维细胞作为滋养层，培养人iPSCs，发现这种人源化的滋养层可产生和维持人 iPSCs的培养，但其培养时间较短(报道的培养代数为7代)；同年，Kristiina等用一种成分明确的无异源蛋白的RegES培养液培养人iPSCs，发现其能长期(> 80代)维持iPSCs的自我更新和多潜能性，但是并没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为 iPSCs。Ruth等用另一种成分明确的mTeSRTM培养液悬浮培养人iPSCs，发现培养17代后， 仍可维持其自我更新和多潜能性，但是该培养体系价格昂贵，且同样没有证明在重编程过程中，该培养液可使人体细胞重编程为iPSCs。因此，进一步开发研究人iPSCs人源化的培养体系，包括重编程过程和维持培养，以及对iPSCs生物学特性的影响，是人iPSCs走向临床应用的重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)作为滋养层培养人诱导多能干细胞(iPSCs)的方法，通过以下技术方案实现(1)滋养层细胞的准备用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三 第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞。人骨髓间充质干细胞采用目前常用的Ficoll-paque密度梯度离心结合贴壁筛选分离培养获得。作为滋养层时，细胞接种到用0. l%gelatin处理后的六孔板上，细胞融合度达80%-90% (约2X 104/cm2)，并用10ug/ml的丝裂霉素C处理2小时灭活，灭活后的细胞M小时内使用；(2)人iPSCs的获得取2-3岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Klf4、Sox2、0ct4和 c-Myc转录因子的逆转录病毒转染两次。第二天在培养体系中加维生素C 25ug/ml，第五天加入VPA2 μ M (共使用5天)，第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天， 换用含bFGF、替代血清的人ESCs培养液。随后每天换液，直到出现类ESCs的克隆，挑选、扩增培养；(3)人iPSCs的扩增培养显微镜下挑选类ESCs的克隆，用IV型胶原酶消化5-10分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上。每天换液。每7-8天传代一次。 扩增后的细胞用机械法传代，即用5ml的玻璃滴管将细胞从滋养层上轻轻刮下，随后轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上；(4)人iPSCs的生物学特性和多潜能性的维持在以人骨髓间充质干细胞为滋养层上扩增培养14代以后，用RT-PCR法鉴定扩增培养后人iPSCs的ESCs特异基因表达情况；同时用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否可向三胚层分化。本专利技术提供了一种用人源化细胞即人骨髓间充质干细胞作为滋养层获得培养人 iPSCs的方法，这种人源化的滋养层细胞可长期维持人iPSCs的生物学特征和多潜能性；由此获得的人iPSCs没有异源细胞的污染，为其临床应用提供了可能性。本专利技术使用人骨髓间充质干细胞代替传统方法中用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增(见实施例4)，且维持了其生物学特性和多潜能性(见实施例5)，为人诱导多能干细胞进入临床应用提供了可能。附图说明图1为技术路线图。图2为第4代人骨髓间充质干细胞。A为灭活前；B为丝裂霉素C灭活后。图3为用人骨髓间充质干细胞作为滋养层获得的人iPSCs。A为成纤维细胞转染 21-25天后，出现的肉芽肿样克隆(标尺为100 μ m)，B为扩增培养后形成的iPSCs克隆(标尺为100 μ m)，C为克隆局部细胞形态(标尺为20 μ m)。图4为第8-11代人iPSCs在以第4代人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的生长曲线。图5为第9、10代人iPSCs在不同供者来源第4代人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中的扩增倍数(hMSCl和hMSC2为女性供者来源，hMSC3为男性供者来源)。图6为RT-PCR检测人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后人ESCs特异基因的表达情况。图7为人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后在体外形成EB向三胚层分化情况。A为EB培养8天后形成的悬浮EB(标尺为50 μ m);B-D为培养14天后EB贴壁分化成的各种类型细胞(标尺为100 μ m) ;E为PT-PCT检测EB 分化后多潜能基因(S0X2和0CT4)和三胚层的标记基因(F0XA2和AFP为内胚层标记基因； MSXl和BRACHYURY为中胚层标记基因；MAP2和PA)(6为外胚层标记基因)表达情况(U表示未分化，D表示分化后)。图8为人iPS/MSC7在人骨髓间充质干细胞为滋养层的培养体系中扩增培养14代以后在NOD-SCID小鼠体内形成畸胎瘤情况。A为长出畸胎瘤的小鼠；B为畸胎瘤内形成的腺样组织(HE染色，标尺为20 μ m);C为畸胎瘤内形成的肌肉样组织(HE染色，标尺为20 μ m)。具体实施例方式本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1 人骨髓间充质干细胞分离培养、冻存复苏 (1)人骨髓间充质干细胞分离培养无菌条件下采集3份健康本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种用人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养人诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：（１）滋养层细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的第三～第五代的人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞，细胞接种到用０．１％ｇｅｌａｔｉｎ处理后的六孔板上，细胞融合度８０％－９０％，并用１０ｕｇ／ｍｌ的丝裂霉素Ｃ处理２小时灭活，灭活后的细胞２４小时内使用；（２）人诱导性多能干细胞的获得：取２－３岁儿童包皮成纤维细胞，用携带有Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４和ｃ－Ｍｙｃ转录因子的逆转录病毒转染两次，第二天在培养体系中加维生素Ｃ ２５ｕｇ／ｍｌ，第五天加入ＶＰＡ２ μＭ，第六天将转染后的成纤维细胞接种到滋养层细胞上，第七天，换用含ｂＦＧＦ、替代血清的人ＥＳＣｓ培养液，随后每天换液，直到出现类ＥＳＣｓ的克隆，挑选、扩增培养；（３）人诱导性多能干细胞的扩增培养：显微镜下挑选类ＥＳＣｓ的克隆，用ＩＶ型胶原酶消化５－１０分钟后，轻轻吹散成小团块，接种到准备好的滋养层细胞上，每天换液，每７－８天传代一次，扩增后的细胞用机械法传代；（４）人诱导性多能干细胞的生物学特性和多潜能性的维持：在以人骨髓间充质干细胞为滋养层上扩增培养１４代以后，用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定扩增培养后人诱导性多能干细胞的ＥＳＣｓ特异基因表达情况，同时用ＥＢ形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否可向三胚层分化。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，张丽飞，郑伟燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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