本发明专利技术为“一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法及其应用”，属生物技术领域。一种香蕉穿孔线虫特异性的循环恒温扩增(LAMP)检测方法，其反应体系中香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测引物RSF3、RSB3、RSFIP、RSBIP和RSLF，通过对罹病植物组织中香蕉穿孔线虫或单头香蕉穿孔线虫DNA提取，LAMP等温扩增，从而快速和特异性检测香蕉穿孔线虫。本发明专利技术的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，在香蕉穿孔线虫现场快速检测和香蕉穿孔线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。
Method for detecting specific LAMP of banana perforation nematode and application thereof
The invention relates to a method for detecting specific LAMP of banana perforated nematode and its application, belonging to the technical field of biotechnology. A circulation of Radopholus similis specific amplification (LAMP) detection method, the reaction system of Radopholus similis specific primers for LAMP detection of RSF3, RSB3, RSFIP, RSBIP and RSLF, the diseased plant tissues or single nematode Radopholus similis DNA extraction, LAMP isothermal amplification, so fast the specificity and detection of Radopholus similis. The detection method of the invention has the advantages of high specificity, high sensitivity, low cost and simple operation, and has high application value in the field detection of the banana perforation nematode and the early diagnosis of the banana perforation nematode disease.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病害的分子生物学检测技术，特别涉及一种香蕉穿孔线虫特异性 LAMP检测引物及LAMP快速分子检测方法
技术介绍
香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，，又名相似穿孔线虫，它是一种具有毁灭性的外来入侵植物检疫性有害线虫，是我国对外植物检疫对象之一。香蕉穿孔线虫 (Radopholus similis)寄主范围也非常广泛，目前已报道的寄主多达360多种，主要分布在在热带及亚热带地区。近年来，随着国际贸易和出国旅游日趋频繁，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进各种花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，因此由寄主植物携带而将该线虫传入中国的可能性和传入风险日益剧增。近年来在我国各口岸多批次截获香蕉穿孔线虫。由于该线虫的寄主植物在中国广泛分布，一旦入侵后将给我国农业生产带来毁灭性的打击和造成严重的损失。一旦香蕉穿孔线虫扩散到田野，则极易定殖和流行。这将给中国的农业生产造成严重危害。在香蕉穿孔线虫的鉴定与检测方面，往往以形态鉴定为主，但因为形态特征细微复杂，变化幅度较大及表型特征不稳定问题，传统形态鉴定往往比较困难，导致误诊，传统形态鉴定过程耗时、费力，需要专业人士操作，且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。在PCR技术上建立起来的分子鉴定方法，一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。目前已有一些利用分子和生化方法鉴定香蕉穿孔线虫的方法，如RFLP、一步双重 PCR和荧光定量PCR。在植物检疫领域中，DNA分子标记是目前线虫学研究中发展较快的一种鉴定手段。线虫种特异性引物PCR扩增检测或双重PCR扩增检测是近年重要植物线虫分子诊断的重要进展之一。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。如Mulholland et al. (1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了 3个引物，通用引物5. SSrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物 ITSl-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSrf和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线 虫。欧师琪、彭德良(0u SQ, Peng DL, 2008)设计构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI，专利技术了大豆孢囊线虫的一步双重PCR检测方法，检测的特异性片段长度为494bp，建立快速准确检测和早期诊断大豆孢囊线虫的分子生物学方法和技术规程， 可以检测大豆孢囊线虫单个孢囊、单头二龄幼虫和雄虫，该项检测技术获得国家专利技术专利 (ZL200510012246. 1). 宛飞、彭德良等(2008)根据马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区的序列特征，对我国甘薯茎线虫两个不同型群体各设计了一对特异性引物。A型甘薯茎线虫特异引物为DDSl/ DDS2，特异扩增片段为252bp ；B型甘薯茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为 485bp ；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测甘薯茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。目前在香蕉穿孔线虫的分子检测方面也进行了基于PCR技术的相关研究。1996年 KaplanD. T.等筛选380个随机引物，从基因组DNA中找到6条差异片段，克隆、测序后设计了一对24bp的特异性引物，可特异扩增Radopholus similis，。Falls et al. (1996)利用 PCR方法扩增rDNA片段来比较两个ITS区及5. 8S基因。基于rDNA片段的RFLPs可用于比较全世界不同的香蕉种植区域的10个香蕉穿孔种群。Elbadri et al. (2002)也对香蕉穿孔线虫的rDNA-ITS做了相关研究，通过研究穿孔线虫(R. . similis)种内rDNA-ITS的变异，测定ITS序列并进行RFLP分析发现，香蕉穿孔线虫种内ITS序列稳定，变异很小。但穿孔线虫(Radopholus)属的不同种间ITS存在差异。国外的研究表明，曾经认为是香蕉穿孔线虫的一个来自澳大利亚种群，经过对rDNA-ITS序列特征和RFLP分析研究，发现该群体实际上是香蕉穿孔线虫的近缘种，最近重新命名和描述为澳洲穿孔线虫新种(Radopholus musicola)、来自越南榴莲和咖啡根系的两个穿孔线虫群体虽然与香蕉穿孔线虫及其近似， 但rDNA-ITS序列和RFLP酶谱都存在差异，分别描述为“榴莲穿孔线虫新种(Radopholus duriophilus)和阿拉伯咖啡穿孔线虫新种(Radopholus arabocoffeae)。近年的分子和细胞遗传学证据表明，香蕉穿孔线虫与柑桔穿孔线虫为同一个种。近年来，我国口岸多年多次截获香蕉穿孔线虫，国内相关单位加大了对香蕉穿孔线虫的检疫检验力度，相继开展了香蕉穿孔线虫的分子特征等相关研究。葛建军等根据NCBI已登录的香蕉穿孔线虫序列聚类比对后根据保守区域设计出穿孔线虫属 (Radopholus)水平上的特异性引物Rl、R2(Rl/2)和香蕉穿孔线虫种水平上的特异性引物 RSURS2 (RS1/2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫，检测精度可达单条水平和实时荧光定量 PCR检测单头香蕉穿孔线虫技术；但是没有从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫。周春娜谢辉等(2006)等利用国外的通用引物研究了香蕉穿孔线虫rDNA-ITS，没有涉及特异性引物。彭德良等根据我国多个口岸截获的香蕉穿孔线ITS克隆测序结果设计出香蕉穿孔线虫特异性引物对(RsFl和RsRl)，以此开发出能够从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫技术， 检测精度可达单条水平，同时也开发出实时荧光定量PCR检测单头香蕉穿孔线虫技术。目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。循环恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，简称 LAMP)是 2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP 反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在恒本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种香蕉穿孔线虫特异性ＬＡＭＰ检测方法，其特征在于：其中的ＬＡＭＰ反应体系中所使用的引物分别是：ＲＳＦ３：５’－ＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＴＣＴＡＧＣＣＴＧ－３’，ＲＳＢ３：５’－ＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＣＧＣＡＣＡＡＣ－３’，ＲＳＦＩＰ：５’－ＧＣＡＣＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡ－ＣＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣ－３’，ＲＳＢＩＰ：５’－ＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＴＴ－ＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣ－３’，ＲＳＬＦ：５’－ＡＧＧＣＧＴＣＧＴＣＣＣＡＡＧＧＴＣＡ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭德良，彭焕，王琼，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。