一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方法技术

本发明专利技术“一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方法”，属于农业生物技术领域。其步骤如下：(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察；其特征在于：所述PCR反应体系中的引物是根据Seq?ID?No.1所示的序列设计的正、反向引物，所述PCR扩增的阳性产物为Seq?ID?No.1所示的序列上正向引物完全互补识别的起始碱基至反向引物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。本发明专利技术的方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。能够为植保工作人员提供可靠的预报参数，以便于及时采取合理的防治措施。

A PCR method for specific detection of wheat stem rust

The invention discloses a PCR method for detecting wheat stalk rust, specifically belonging to the field of agricultural biotechnology. The steps are as follows: (1) preparation of DNA template to be measured; (2) preparation of PCR reaction system containing the DNA template to be measured; (3) to observe the PCR reaction and results; which is characterized in that the primer PCR reaction system is based on the Seq? ID? No.1 shows sequence design the forward and reverse primers, the positive products of PCR amplification of Seq? ID? No.1 sequence is shown on the forward primer complementary nucleotide fragment between the end base base to start reverse primer recognition complete identification of the. The method of the invention has the advantages of good specificity, high sensitivity, simple and fast operation. It can provide reliable prediction parameters for plant protection staff, so as to take reasonable control measures in a timely manner.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属农业生物
，特别是涉及一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方法。
技术介绍
小麦锈病致病菌包括小麦秆锈菌Puccinia graminis f. sp. tritici、小麦条锈菌 Puccinia striiformis f. sp. tritici禾P小麦叶绣菌Puccinia triticina f. sp. tritici, 是侵染小麦等禾谷类作物的重要致病真菌。小麦秆锈病是世界范围的小麦病害，在种植小 麦的国家和地区均有发生，主要分布于北美、澳洲及非洲等地。我国主要在华东沿海、长江 流域和福建、广东、广西的冬麦区及东北、内蒙古、西北等春麦区发生流行，给小麦生产造成 严重损失。1949 1966年的17年间，福建省就有6次大发生，重者损失40% 50%。1956 年江苏省的流行，造成减产50% 80%，个别田块甚至绝收。近30年来，由于推广抗病品 种，基本上控制了该病的流行和危害。但在一些流行区，感病品种仍占相当大的面积，流行 具有潜在的可能。1998年在非洲的乌干达发现新型的强致病力小麦秆锈菌Ug99，可克服已 在世界应用30余年的小麦抗病基因Sr31，导致所传播区域内小麦最高减产80%，这一新型 小种还没传播到中国，但是在中国应提早加强小麦秆锈病的研究和秆锈菌小种的监测。病害的早期诊断检测是准确测报和有效防控的基础和前提。长期以来，锈病的诊 断主要基于病原菌的生物学及病害症状特征，其预测预报主要基于定期、大规模的田间病 叶调查和温室病菌的活体分离、培养和鉴定。而在小麦锈病潜育阶段，寄主的发病症状不易 观察，难以界定初侵染的时期和规模，而且调查鉴定结果的准确性和可靠性在很大程度上 依赖于调查测报人员的经验和技术水平。传统锈病诊断及病情预报方法耗时费工，难以满 足病害的快速、高通量诊断检测实际需求。因此，有必要研发简单快捷、灵敏准确的小麦锈 病快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预报预测的准确性和快捷性均具有重要 的理论意义和实际应用价值。小麦3种锈病菌的田间症状非常相似，一些基层植保工作者时常会产生错报、误 报的情况，影响了数据的可靠性及预测预报的准确性，进而影响防治策略与防治措施的合 理性。因此利用分子生物学技术，采用PCR、琼脂糖凝胶电泳等一系列手段来区分小麦条锈 病、叶锈病和秆锈病3种致病菌是比较准确、快捷的病害诊断检测技术。目前，中国农业科学院植物保护研究所麦类病害实验室已经针对这一生产中面 临的实际问题，建立了小麦条锈菌和叶锈菌生理小种的特异性分子诊断检测技术(Cao et al. ,2007 ；曹丽华等，2007)。作为一种重要的小麦专性寄生菌，秆锈菌在微卫星分子标记方 面的研究远远滞后于其他小麦专性寄生菌，如叶锈菌和条锈菌，其SSR标记已有许多研究， 并公开发表了大量可以直接利用的引物序列。而现有秆锈菌的微卫星标记数量非常有限， 仅有LESJ. SZABO分离的M对引物可用(LES J. SZAB0, 2007)。这严重制约了微卫星标记在 秆锈菌检测方面的研究和应用。因此，迫切需要更多独立分离的、多态性丰富的秆锈菌微卫 星标记。SSR(simple sequence repeats)又称短串联重复序列或简单重复序列，是一类广 泛存在于原核、真核生物基因组中的串联重复DNA。SSR核心序列一般为以1 6bp核苷酸 为单位的重复序列，侧翼序列大多是保守的单拷贝序列。微卫星具有较快的变异速率，而且 这些变异大都位于可积累的中性突变非编码区，因此微卫星具有丰富的多态性。SSR标记 最显著的优点是多态性高、信息量大；一般按照孟德尔方式分离，而呈共显性遗传，故可以 区分杂合子和纯合子，对个体鉴定具有重要意义；带型简单，实验结果稳定可靠，重复性高； 易于操作，对DNA质量要求不高，并且用量不大，甚至DNA轻度降解后，仍能扩增出目的微卫 星座位序列。目前许多物种已有现成的、商品化的SSR引物，并已广泛应用于遗传图谱的构 建、遗传多样性分析、基因标记、定位、克隆及辅助育种等。但由于SSR标记必须根据微卫 星两侧的序列设计引物，因此在引物设计之前必须搞清微卫星侧翼的序列，这使得SSR标 记的获得一般需要建立、筛选基因组文库，克隆测序等一系列实验，因此，人力、物力消耗较 大。如何快速获得微卫星序列是微卫星应用中最关键的一步。尽管公共数据库如GenBank、 EMBL和DDBJ上可以直接检索到一些物种的微卫星序列，但大多集中在模式物种及经济物 种上。对于像小麦秆锈菌这种微卫星序列资源相对较少的物种来说，通过实验方法来获得 更多的微卫星序列是必须的。Zane 等(2002)提出 FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats,借助含重复序列的AFLP序列快速分离SSR)，是将现阶段的微卫星开发策略很好 的结合起来的一种开发SSR的方法。该方法先对基因组DNA进行酶切，加上AFLP接头，用 带一个选择性碱基的引物组进行1次PCR扩增，用生物素标记的探针与变性的扩增产物杂 交，用磁珠富集富含SSR的片段，然后经一系列洗涤除去非特异性杂交，变性分离DNA片段 进行第2次扩增得到富含SSR的双链DNA，连接载体转化克隆测序。这种方法快速简单并 且高效，省去了很多不必要的步骤，该技术在鸟类、鱼类以及很多植物中的应用十分成熟。 目前逐渐开始在植物病原菌中应用，2005年Nakabonge等用此方法分离了 Cryphonectria eucalypti中的SSR标记；Hunter等Q006)在一种桉树属重要的叶部病害病原菌 Mycosphaerella nubilosa 中开发了 10 个微卫星标记；Barrtee 等 0006)从 Melampsora Iini开发了 11对多态性引物；Barnes等^)08)也用此法对红松疫病菌(Dothistroma septosporum)开发了 12对多态性引物。但此法尚未对小麦秆锈菌的多态性引物的开发进 行研究报道。
技术实现思路
本专利技术根据上述领域的空白和需求，提供一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方 法，该方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。一种特异性检测小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的PCR方法，其步骤如下(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察；其特征在于所述PCR反应体系中的引物是根据kq ID No. 1所示的序列设计的 正、反向引物，所述PCR扩增的阳性产物ID No. 1所示序列上正向引物完全互补识别 的起始碱基至反向弓I物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。所述正向引物为Pgt-FSl-F :5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘，所述反向引物为Pgt-FSl-R :5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3 ‘，扩增产物为 330bp。所述PCR反应体系如下模板DNA 20nmol，正向引物40pmol，反向引物40pmol， 2 X PCR Master Mix 10 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。所述PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种特异性检测小麦秆锈菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）的ＰＣＲ方法，其步骤如下：（１）制备待测ＤＮＡ模板；（２）预备含有所述待测ＤＮＡ模板的ＰＣＲ反应体系；（３）进行ＰＣＲ反应及结果观察；其特征在于：所述ＰＣＲ反应体系中的引物是根据Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示的序列设计的正、反向引物，所述ＰＣＲ扩增的阳性产物为Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示的序列上正向引物完全互补识别的起始碱基至反向引物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘太国，王曦，陈万权，高利，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11