化合物西替欧呋喃的用途制造技术

本发明专利技术提供具有如图所示结构式的化合物：西替欧呋喃（Ⅰ）：该化合物西替欧呋喃与ＨＩＶ－１整合酶具有很高结合活性（Ｋ↓［Ｄ］＝１６．４μＭ），并且在底物竞争测试中能够有效的抑制整合酶对底物的结合（ＩＣ↓［５０］＝１２０μＭ）。因此该化合物显示出极高的成药价值。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及二倍半萜类化合物西替欧呋喃(scalarafuran)的制备方法及其用途。
技术介绍
自1981年在美国发现首例艾滋病AIDS(acquired immunodeficiency syndrome，获得性免疫缺陷病症)患者以来，艾滋病已在全球的180多个国家和地区快速蔓延。目前全球艾滋病患者和病毒携带者总数已达到4,200多万，这其中中国有近100万，在亚洲居第2位，在全球居第14位。而且近年来中国艾滋病病例数在以平均每年30-40％的速度快速增长，已经成为一个日益严峻的公共安全问题。HIV病毒作为AIDS的病原体，其感染人体后在体内的复制过程需要整合酶(integrase，IN)的参与才能完成。IN能完成HIV双链DNA分子整合进入宿主染色体的过程。IN在体内具有3’切割的内切酶活性和链转移活性。IN先在HIV线形平端DNA的双链两端按3’-5’方向切割两个碱基，形成CA-OH-3’的凹端，在宿主细胞的DNA双链上切开一个5bp的缺口；然后HIV DNA双链的CA-OH-3’的凹端在IN的作用下与宿主细胞DNA链切口的5bp以磷酸二酯键的形式结合形成整合中间体；再在细胞内某些酶的作用机制下去掉病毒DNA5’末端未配对的两个碱基，修复病毒及宿主细胞DNA链的缺口。IN是由288个氨基酸组成的分子量32kD的蛋白质，它在结构上分为三个部分N端区、核心区和C端区。N端区由1-50位氨基酸组成，是一个保守的HHCC锌指结构域，具有病毒DNA识别功能，此外还有促进IN四聚化和增强催化活性的功能。核心区由52-210位氨基酸组成，是IN催化最重要的部位。它包含三个酸性氨基酸残基(Asp64、Asp116和Glu152)，排列成DD35E型，是非常保守的结构，是内核酶和核苷转移酶的位点。该部位和一个或两个二价阳离子(Mg2+或Mn2+)结合对催化活性是必需的。C端区是IN中保守性最小的区域，由213-288位氨基酸组成。它包含核定位信号，能非特异性的结合DNA，还参与IN的多聚化。IN三个区的晶体结构及与各种抑制剂的复合物晶体结构都已得到，但是IN全长的晶体结构仍然没有解决。由于IN在HIV病毒复制过程中起着不可缺少的重要作用，而且IN在人体细胞内没有IN的功能类似物，因而IN是AIDS治疗的理想靶标。寻找新的IN抑制剂，结合HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂联合用药，可以提高抗病毒活性、降低毒副作用和减少耐药性，是很有意义的治疗方案。到目前为止发现的IN的抑制剂包括DNA结合剂、寡核苷酸及核苷类似物、硫酸酯类似物、多肽和羟基取代的芳香化合物等。根据这些抑制剂跟IN的结合位点可以分为四类。1核苷结合位点最早用做IN抑制剂研究的核苷化合物是AZT及其衍生物AZTMP。AZT单磷酸、双磷酸和三磷酸均具有抗IN链转移活性。它们对IN的抑制是通过干扰IN与DNA的结合实现的。IN的K156、K159和K160是单核苷的结合位点，其中高度保守的K159是IN与DNA结合的关键。随后发现二核苷及异二核苷，还有寡核苷酸类化合物也有抑制IN的活性。2金属离子结合位点多羟基芳香化合物与IN的二价金属离子(Mg2+或Mn2+)鳌合从而抑制IN的活性。这是具有IN抑制作用的化合物中被报道最多的，有木脂内酯类、香豆素单体或二聚体类、苯乙烯喹啉类和含邻苯二酚的螺环类蒽醌类等。这类化合物在体外测定中对IN有很好的抑制作用，但在细胞培养中毒性太大。3LTR(长末端重复)DNA序列结合位点这类抑制剂目前已经报道的有DNA双螺旋小沟结合剂(如纺锤霉素和偏端霉素)、DNA嵌入剂(如多柔比星)和拓扑异构酶抑制剂(如米多蒽醌)。4其他位点2000年默克公司发现了两种能遏制IN的二酮酸类抑制剂，这是目前为止唯一一类选择性作用于IN的抑制剂。这类化合物对整合反应的第二步有选择性抑制作用。除此之外其他的抑制剂都可能同时有多个作用位点。尽管对IN的抑制剂已有十余年的研究，但是IN抑制剂目前没有药物上市，仅有少数进入临床。究其原因，主要有两方面的限制一是活性测定方法的限制基于细胞培养的测定无法确定化合物是否直接作用于IN，而分子水平的筛选又有太多假阳性；二是结构生物学方面的限制IN的晶体结构及其DNA底物复合物的晶体结构都没有确定，而且整合这个复杂的生化过程中还有许多机理没弄清楚。目前对AIDS病的治疗主要采用联合用药的策略，即采用HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂联合用药，但是治疗过程中HIV病毒突变导致的耐药性以及逆转录酶和蛋白酶抑制剂的毒副作用情况严重。因此，寻找和发现HIV-1整合酶抑制剂成为AIDS治疗的新的重要主题。从天然产物中发现HIV-1整合酶的新型抑制剂，对于进一步设计合成新型有效的HIV-1整合酶抑制剂及AIDS的治疗具有重大的开拓性的意义。本专利技术者发现了来源于海洋生物海绵，具有新颖五环二倍半萜结构的天然产物-化合物西替欧呋喃。该化合物与HIV-1整合酶具有很高结合活性(KD＝16.4μM)，并且在底物竞争测试中能够有效的抑制整合酶对底物的结合(IC50＝120μM)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供对HIV-1整合酶有抑制作用的化合物西替欧呋喃。本专利技术的另一个目的是提供该化合物的制备方法。本专利技术的再一个目的是提供运用生物传感器，利用表面等离子共振原理，方便、快捷、低耗的筛选出对HIV-1整合酶有结合活性的小分子，进一步作底物竞争实验确定出该化合物对HIV-1整合酶的抑制活性。本专利技术是这样实施的本专利技术提供具有如下结构式的化合物西替欧呋喃 西替欧呋喃本专利技术提供了化合物西替欧呋喃的制备方法将冰冻的新鲜海绵切碎，用丙酮超声提取，丙酮提取液减压浓缩(温度低于30℃)，浓缩物以蒸馏水悬浮，用乙醚萃取，乙醚萃取液经减压浓缩后得到浸膏，该浸膏通过硅胶(200-300目)柱层析[石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯梯度洗脱]，洗脱液合并得到七个部分，其中由石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯78/12洗脱得到的第五部分再进行凝胶LH-20(氯仿洗脱)柱层析，随后再通过硅胶柱层析，用石油醚(60-90℃)/乙醚75/25洗脱，得到化合物西替欧呋喃(Scalaranfuran)。本发现利用生物传感器技术验证HIV-1整合酶抑制剂活性的实验由以下步骤组成。1.用生物传感器测定西替欧呋喃与HIV-1整合酶的结合活性。(1)GST标记的HIV-1整合酶(IN，integrase)的克隆本步骤采用基因工程上游方法，选用pGEX-4T-1载体构建IN融合蛋白的质粒(pGEX-4T-1-IN)。a.用PCR技术从pUC18-IN质粒获得IN的DNA片段(基因序列依据AF040373(GENEBANK))。引物FW5′-ata tgg atc ctt ttta gat gga ata gat-3′RV5′-ata tct cga gct aat cct cat cct g-3′94℃变性5min，然后开始循环94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，重复29次循环，然后72℃10min。采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并回收PCR片段。b.将IN PCR片段克隆到载体pGEX-4T-1上IN PCR产物和pGEX-4T-1分别用本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有如下结构式的化合物西替欧呋喃的用途，在它对ＨＩＶ－１整合酶具有高结合活性＊＊＊Ⅰ。

【技术特征摘要】
1.具有如下结构式的化合物西替欧呋喃的用途，在它对HIV-1整合酶具有高结合活性2.根据权利要求1所述的化合物西替欧呋喃的用途，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈旭，郭跃伟，蒋华良，于志国，杜丽，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]