用于抑制蓬乱蛋白的组合物和方法技术

Ｗｎｔ信号途径涉及胚胎发育以及Ｍ肿瘤发生。在经典和非经典Ｗｎｔ信号途径中，蓬乱蛋白（ＤｖＩ）将Ｗｎｔ信号从卷曲蛋白受体（Ｆｚ）传递到下游组分，并且ＤｖＩ的ＰＤＺ结构域在所述的这两种途径中起着重要的作用，并且ＤｖＩ的ＰＤＺ结构域可直接与Ｆｚ受体结合。在本发明专利技术中使用ＮＭＲ－辅助的虚拟配体筛选，鉴定了多种化合物并发现可与ＤｖＩ的ＰＤＺ结构域结合。采用了分子动力学模拟来详细分析了ＰＤＺ结构域与这些化合物之间的结合。这些化合物为合理设计ＰＤＺ结构域的高亲和力抑制剂奠定了基础，该抑制剂可通过干扰Ｆｚ－ＤｖＩ的相互作用来阻断Ｗｎｔ信号。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关专利申请的参考本专利申请是于2005年3月18日申请的，标题为“Sclerostin andthe Inhibition on Wnt Signaling and Bone Formation”的专利申请案(Dan Wu等)的部分继续申请。本申请与2004年5月19日提交的标题为“Compositions and Methods for the Stimulation orEnhancement of Bone Formation and the Self-Renewal of Cells”，申请号为10/849,643的专利申请案相关，并在此将其内容通过全文引用作为参考。本申请还与2004年5月19日申请的，标题为“Compositions and Methods for Bone Formation and Remodeling”，申请号为10/849/067的专利申请案相关，并在此将其内容通过全文引用作为参考。专利
本专利技术涉及蓬乱蛋白(Dishevelled protein)，在经典和非经典的Wnt信号途径中，该蛋白将Wnt信号从跨膜卷曲蛋白受体(receptor Frizzled)传递到下游组分。本专利技术涉及多种疾病的治疗中的治疗方法、组合物及其用途的领域，所述的疾病是由涉及发病机理的Wnt信号传递引起的。更特别的是，所述组合物和方法针对干扰卷曲蛋白-蓬乱蛋白相互作用的化合物。该化合物是用筛选法从化合物库确定。也可以修饰这些化合物来产生同样有效起作用的，在文库或自然界中尚未发现的衍生物或类似物。 本申请案中引用或确定的所有专利、专利申请案、专利出版物、科学文献等在此通过将其全文引入作为参考，以便更全面地描述本专利技术所属领域的状态。
技术介绍
Wnt信号途径在胚胎发育和胚后期发育中起着重要的作用，并且参与了肿瘤发生。在经典的Wnt-β-连环蛋白途径中，分泌的Wnt糖蛋白与7-跨膜区卷曲蛋白(Fz)受体结合并激活细胞内的蓬乱蛋白(Dvl)。激活的Dvl蛋白随后抑制了糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)；这种抑制作用导致由GSK-3β、腺瘤性结肠息肉(APC)蛋白、阿新蛋白(axin)和β-连环蛋白形成的分子复合物失去稳定性，并降低了GSK-3β磷酸化β-连环蛋白的能力。未磷酸化的β-连环蛋白逃脱了泛素化和降解，并在细胞质中积聚。这种积聚导致β-连环蛋白转移进细胞核中，在这里，它刺激Wnt靶基因，例如编码T细胞因子/淋巴强化因子(Tcf/Lef)的基因的转录。许多报道致力于参与瘤形成发生的Wnt-β-连环蛋白信号途径组分的突变。 Wnt途径与癌症之间的关联可追溯到Wnt信号途径的最初发现第一种脊椎动物Wnt生长因子被确定为一种细胞癌基因的产物(Wnt-1)，其在鼠乳腺癌中通过前病毒插入激活。可能支持Wnt信号途径在肿瘤生成中起作用的最有力证据是下述发现，大约85％的结肠直肠癌表征为APC(Wnt途径的一种关键组分)的突变。Wnt信号途径的成员也涉及多种小儿癌症例如伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、髓母细胞瘤、维尔姆斯氏肿瘤以及成神经细胞瘤的发病机理。此外，异常的Wnt信号传递还涉及其它疾病，例如骨质疏松症和糖尿病。 Dvl将Wnt信号从膜结合受体传递到下游组分，并因而在Wnt信号途径中起着重要的作用。在整个动物界，Dvl蛋白质是高度保守的。在哺乳动物系统中，已经鉴定了三种Dvl同系物，即Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3。所有这三种人Dvl基因都广泛表达于胎儿和成人组织，包括脑、肺、肾、骨骼肌以及心脏中。Dvl蛋白由N-端DIX结构域、中央PDZ基序和C-端DEP结构域组成。在这三个组成部分中，PDZ结构域看起来在经典和非经典Wnt途径两者中都起重要的作用。的确，Dvl的PDZ结构域不仅在上述两种途径间起显著作用，而且还涉及核定位。目前，通过采用核磁共振(NMR)光谱研究了小鼠Dvl-1(mDv11)的PDZ结构域(残基247至341)与其结合伴侣之间的相互作用。mDv11的PDZ结构域的肽-相互作用位点与序列没有明显同源性的多种分子相互作用。尽管它不是一个典型的PDZ-结合基序，一种与mDv11的PDZ结构域结合的肽是Fz的保守基序(KTXXXW)，该基序开始于第七跨膜区后的第三个氨基酸。这一发现表明，在Fz和Dvl之间存在直接的相互作用，并且揭示了一种以前未知的、Wnt信号途径的膜-结合受体和下游组分之间的联系。因此，Dvl的PDZ结构域的抑制剂可能会在Dvl水平上有效地阻断Wnt信号途径。 Dvl的PDZ结构域在Wnt-β-连环蛋白途径中的特殊作用使它成为了一个理想的药物靶标。Dvl中的PDZ结构域的小的有机抑制剂可能可用于研究分子机制，并可用于制备药物制剂，该药物制剂靶向其中Wnt信号传递涉及发病机理的肿瘤或其它疾病。根据Dvl的PDZ结构域的结构，采用虚拟的配体筛选鉴定了结合Dvl的PDZ结构域的非肽类化合物NCI668036。进一步的NMR试验证实，该化合物结合至PDZ结构域表面的肽-结合位点；该化合物的结合亲和力(离解常数，KD)通过荧光光谱测量。另外，我们对这种化合物与PDZ结构域之间的相互作用以及一种已知PDZ结构域抑制剂(Dapper)的C-端区与PDZ结构域之间的相互作用进行了分子动力学(MD)模拟，并且我们比较了这两种相互作用的结合自由能，结合自由能通过分子力学Poisson-Boltzman表面积(MM-PBSA)方法计算。 专利技术概述 本专利技术是基于涉及Wnt信号途径的细胞内蓬乱蛋白(Dvl)、或者所述蛋白质的同系物的活化或失活。 在一个方面，本专利技术提供了采用虚拟筛选(virtual screening)来鉴定化合物的方法。 在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了用于指导NMR-辅助的虚拟筛选的方法。 在另一方面，本专利技术提供了结合蓬乱蛋白或所述蓬乱蛋白的同系物而干扰这些蛋白质与卷曲蛋白受体、或卷曲蛋白受体的同系物的相互作用的化合物。 在更另外的方面，本专利技术提供了结合蓬乱蛋白的PDZ结构域而干扰与跨膜受体例如卷曲蛋白受体相互作用的化合物。 根据下面的本专利技术详述，本专利技术的其它方面对本领域的一般技术人员将是显而易见的。 专利技术详述 基于结构的配体筛选 通过利用基于结构的虚拟筛选，对潜在的Dvl的PDZ结构域的抑制剂进行了搜索。PDZ是一个具有2个α螺旋和6个β片层的标准蛋白质-相互作用结构域。αB螺旋和βB折叠，与在βB之前的环(loop)区一起形成了一个肽-结合口袋(cleft)。在它们的晶体-复合物结构中，Dapper肽(源自Dvl的PDZ结构域的结合伴侣之一)与PDZ结构域的βB片层中的残基Leu265、Gly266、Ile267和Ile269一起形成氢键。 为了鉴定可结合至这种沟并干扰PDZ结构域与其结合伴侣之间相互作用的小的有机化合物，通过采用程序UNITYTM，即在软件包SYBYLTM(Tripos公司)中的一个模块设计一个查询条件(query)。该查询条件由PDZ结构域上的两个氢键供体(Gly266和Ile269的骨架酰胺氮)和两个氢键受体(Ile267和Ile269的羰基氧)组成，空间约束为0.3- 的容本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗多种癌性疾病和其它疾病或哺乳动物受试者中Ｗｎｔ信号通路起重要作用的任何其它疾病的方法，所述的癌性疾病包括结肠直肠癌、硬纤维瘤、子宫内膜癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、髓母细胞瘤、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、肝胚细胞瘤，所述的其它疾病包括糖尿病、脱发、骨折、骨病、骨损伤、骨量丧失、汗腺疾病、乳腺疾病，所述方法包括施用防止膜－结合受体与Ｗｎｔ信号途径的组分结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任意组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J郑，J单，D吴，
申请(专利权)人：ENZO生化公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]