【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对生物来源标本所含的基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的 DNA含量进行测定的方法。
技术介绍
作为用于评价生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的DNA的甲基化状 态的方法，例如，有测定在基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA的含量的方法 (例如，参照Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11 ；22(15) :2990_7、和Proc Natl Acad Sci U S Α. 1997 Mar 18 ；94 (6) :2284_9)。在该测定方法中，首先需要从基因组DNA来源的DNA试 样中提取含有目标DNA区域的DNA，提取操作十分繁杂。另外，作为测定被提取的DNA的目标区域中的被甲基化了的DNA含量的方法，已知 有以下的方法，例如(1)使用亚硫酸盐等修饰该DNA之后，将其供于DNA聚合酶引起的DNA 合成的链反应(Polymerase Chain Reaction (聚合酶链反应)；以下有时记为PCR)，从而将 目标区域扩增的方法；(2)使用甲基化敏感性限制酶将该DNA消化后，将其供于PCR，从而使 目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中，用于甲基化的检测的DNA的修饰以及其后的 生成物的精制、用于PCR的反应系的制备、DNA扩增的确认等中均需要耗时。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种简便测定生物来源标本所含的基因组DNA中目标 DNA区域中的被甲基化了的DNA含量的方法。即，本专利技术提供以下方案。[专利技术1]一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域...
【技术保护点】
一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组ＤＮＡ中目标ＤＮＡ区域中的被甲基化了的ＤＮＡ含量进行测定的方法，具有以下工序： （１）第一工序，其中，对生物来源标本所含基因组ＤＮＡ来源的ＤＮＡ试样，进行利用甲基化敏感性限制酶的消化处理， （２）第二工序，其中，从由第一工序获得的经消化处理了的ＤＮＡ试样获取含有目标ＤＮＡ区域的单链ＤＮＡ（正链），使该单链ＤＮＡ（正链）与单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述单链ＤＮＡ，上述单链固定化寡核苷酸具有对该单链ＤＮＡ的３’末端的一部分有互补性的碱基序列，该单链ＤＮＡ的３’末端的一部分不含上述目标ＤＮＡ区域， （３）第三工序，其中，将由第二工序选择的单链ＤＮＡ作为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，使该引物１次延伸，从而使上述单链ＤＮＡ延伸形成双链ＤＮＡ，以及， （４）第四工序，其中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将由第三工序获得的延伸形成的双链ＤＮＡ暂时分离成单链状态的步骤（前步骤），并且，作为本步骤，具有第Ａ步骤（本步骤）和第Ｂ步骤（本步骤）， （ａ）第Ａ步骤，其具有：通过使生成的为单链状态的ＤＮＡ（正链）与上述单链固定化寡核苷酸（负...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2008-3-25 2008-0779661.一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化 了的DNA含量进行测定的方法，具有以下工序(1)第一工序，其中，对生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样，进行利用甲基化 敏感性限制酶的消化处理，(2)第二工序，其中，从由第一工序获得的经消化处理了的DNA试样获取含有目标DNA 区域的单链DNA (正链)，使该单链DNA (正链)与单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择 上述单链DNA，上述单链固定化寡核苷酸具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的 碱基序列，该单链DNA的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域，(3)第三工序，其中，将由第二工序选择的单链DNA作为模板，将上述单链固定化寡核 苷酸作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA，以及，(4)第四工序，其中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将由第三工序获得的延伸形成 的双链DNA暂时分离成单链状态的步骤(前步骤)，并且，作为本步骤，具有第A步骤(本步 骤)和第B步骤(本步骤)，(a)第A步骤，其具有通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与上述单链固定化寡 核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第Al步骤；和将在第Al步骤 选择的为单链状态的DNA为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，通过使该引物1次 延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第A2步骤，(b)第B步骤，其中，将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序 列(正链)的引物(反向引物)作为延伸引物，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链 状态的DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列(正链)是对上述为单链状态的DNA (负链) 所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，上述为单链状 态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱 基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧，进而，将由上述各本步骤获得的延伸形成了的双链DNA暂时分离成单链状态后，进行 反复操作，从而将上述目标DNA区域中的被甲基化了的DNA扩增到可以检测的量，将扩增了 的DNA的量定量。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链 DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分有互补性的碱基序列的单链固定化寡 核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对，上述单链DNA的3’末端的 一部分不含上述目标DNA区域。3.根据权利要求2所述的方法，其中，二价阳离子为镁离子。4.一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之前，追加有向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端 的一部分有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的追加前步骤，其 中，上述单链DNA(正链)的3’末端的一部分不含上述目标DNA区域，并且，作为第四工序的各本步骤，还追加有下述的1个步骤，(c)第C步骤(本步骤)，其具有(i)通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中被添加到反应系内 的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第Cl步骤，以及，( )将由第Cl步骤选择的为单链状态的DNA作为模板，将上述单链寡核苷酸(负链) 作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第C2步骤。5.一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之后，追加有向反应系内添加具有对上述含有目标DNA区域的单链DNA(正链)的3’末端 的一部分有互补性的碱基序列、且为游离状态的单链寡核苷酸(负链)的追加前步骤，其 中，单链DNA(正链)的3，末端的一部分不含上述目标DNA区域，并且，具有将经历第三工序及上述追加前步骤而得的作为未消化物的延伸形成的双链DNA 暂时分离成单链状态的追加再前步骤，其中，所述双链DNA为在上述甲基化敏感性限制酶 的识别位点不含非甲基状态的CpG对的延伸形成的双链DNA，并且， 作为第四工序的各本步骤，追加有下述的1个步骤， (c)第C步骤(本步骤)，其具有(i)通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与在上述追加前步骤中被添加到了反应系 内的单链寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第Cl步骤，( )将在第Cl步骤选择的为单链状态的DNA作为模板，将上述单链寡核苷酸(负链) 作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第C2步骤。6.一种甲基化比例的测定方法，其中，作为权利要求1 5中任一项所述方法的工序， 还追加有下述2个工序，(5)不进行权利要求1 5中任一项所述方法的第一工序，而进行权利要求1 5中任 一项所述方法中的第二工序到第四工序，从而将上述目标DNA区域的DNA扩增到能够检测 的量，再将经扩增了的DNA的量定量的第五工序，其中，上述目标DNA区域的DNA是被甲基 化了的DNA及未被甲基化的DNA的总量，以及，(6)基于将利用权利要求1 5中任一项所述的第四工序定量了的DNA的量与利用第 五工序定量了的DNA的量比较而得的差异，计算上述目标DNA区域中被甲基化了的DNA的 比例的第六工序。7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血清或 血浆。8.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为哺乳动物的血液或 体液。9.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，生物来源标本为细胞溶解液或组织 溶解液。10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，生物来源标本所含基因组DNA来 源的DNA试样为被限制酶事先消化处理而成的DNA试样，所述限制酶不以该基因组DNA具 有的目标DNA区域为识别剪切位点。11.根据权利要求1 10中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：冨原祥隆，佐藤日出夫，樽井弘和，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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