检验野生种蔷薇中有无与园艺种月季的杂交的方法技术

本发明专利技术提供一种方法，其特征在于，在检验作为被检对象的野生种蔷薇与园艺种月季是否发生杂交的方法中，分析在由该被检对象蔷薇得到的个体中是否存在作为指标的包含转座子的ＫＳＮ基因，如果该包含转座子的ＫＳＮ基因存在，则判定该被检对象蔷薇与园艺种月季发生杂交。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。技术背景在花卉产业中具有新的性状的花总是倍受珍惜，因此对于这种花卉植 物的开发在产业上非常重要。主要是通过采用交配的品种改良来培育具有 各种性状的品种。但是，采用交配的品种改良，因为可利用的基因资源限 定于可交配的近缘植物，所以可导入的颜色、性状受到限定的情况很多， 很少有单一植物种具有多种多样的颜色、性状。以颜色为例，无法通过采用交配而进行的品种改良开发出蓝色的月季、康乃馨、黄色的牵牛花、天竺葵等。但是，如果利用基因重组，可将各种基因超越种的障碍而导入任意的 植物中，通过人为改变植物的代谢等从而实现多彩的性状。例如有以下例 子，即在花瓣中不能生产花翠素的月季、康乃馨中，通过使用于合成花 翠素所必需的类黄酮3' ,5'-羟基化酶基因进行表达，产生花翠素，从而 制作自然中所没有的兰色的花(Tanaka 2006)。但是，进行这样人工制作的基因重组植物的研究开发、栽培、流通等 在日本需要遵守通过规范基因重组生物等的使用等以确保生物多样性的 相关法律(卡塔赫纳法)。在其他国家也根据同样的法律，以限制基因重 组植物在野外的栽培等。特别是对于花粉具有可育性、且可杂交的近缘野 生种在日本国内大量存在的植物，需要对杂交性、即基因从重组植物向近 缘野生种扩散的可能性进行评价，这被规定为一种义务。象蔷薇这样在日本国内近缘野生种多数是自生的，而且这些蔷薇开花 多、结实多时，对于园艺种与近缘野生种有无杂交，分析量庞大，所以需要确立简便且准确的分析技术。目前为止的报告中，己报告了利用微卫星作为分子标记的技术(Debener 2003,2006)。此外，也可通过利用流式细 胞术确定倍数性的鉴定法进行分析。但是，任何一种方法都存在缺乏准确 性、通用性、简便性的问题。此外，因为现代月季的园艺种是通过将8种左 右的野生种进行人工杂交而制作的，所以获得区别园艺种和野生种的DNA标 记并不容易。有报告指出在本专利技术中作为指标基因的KSN基因，是从单瓣月季花( Rosa chinensis spontanea)中获取的与月季的四季开花性相关的基因， 该基因是在一季开花的月季的KSN基因中插入约9kb的转座子而产生的基因 。通过插入转座子，该基因的表达受到抑制，在茎顶形成花芽的抑制得到 解除，所以促进了花芽形成，从而具有四季开花性(岩田等、公开号2006-149202)。已分析获知园艺种月季在纯合子中含有插入了转座子的该基因。另 一方面野生种蔷薇原则上在纯合子中含有不包含转座子的KSN基因。此外，月季(Rosa chinensis)是作为月季园艺种的祖先的野生种之 一， 一季开花，单辦月季花(Rosa chinensis spontanea)是其突变体系，四季开花。专利文献l日本特开2006-149202号公报
技术实现思路
关于检验蔷薇野生种中有无与月季园艺种杂交的方法，到目前为止虽 然也有报告，但缺乏通用性。其它也有值得考虑的方法，但缺乏简便性、 准确性。需要可解决这些缺点并且对于象蔷薇这样具有结果性、近缘野生 种大量存在的植物，可检验野生种与园艺种是否发生杂交的方法。为了分析基因重组植物的基因扩散的可能性，对于庞大的个体数量检 验有无杂交时，特别需要可简便地检验野生种蔷薇是否以导入了基因的园 艺种月季为花粉亲本发生杂交的方法。因此，本专利技术提供使用可简便地检 验作为被检体的野生种蔷薇与导入基因的园艺种月季的花粉是否发生杂交的方法。本专利技术者为了完成上述课题进行各种研究的结果，设想在野生种蔷薇中，包含转座子的KSN基因仅在与园艺种月季杂交时被检测出来，通过将包 含转座子的KSN基因作为指标，完成解决了上述课题，并且完成了本专利技术。 因此，本专利技术提供一种方法，其特征在于，在检验作为被检对象的野 生种蔷薇与园艺种月季是否发生杂交的方法中，分析该被检对象蔷薇中是 否存在包含转座子的KSN基因，如果该KSN基因存在，则判定该被检对象蔷薇与园艺种月季发生杂交。通常情况下，在重组植物的生物多样性影响评价试验中，在蔷薇的园 艺种和野生种的杂交方面，存在园艺种的花粉飞散而与周边的野生种发生 杂交的问题。因此，在本专利技术的方法中，典型的是母本为野生种蔷薇，父 本为园艺种月季。此外，典型的是上述园艺种月季为导入基因的基因重组 月季，这种情况下作为基因，例如是与颜色相关的基因、例如来自堇菜科 三色堇的类黄酮3' ，5'-羟基化酶基因。附图说明图1表示利用PCR法检测KSN基因的结果。利用PCR检测的含有内含子的K SN基因及GAPDH基因(内部参照)的特异性扩增产物的位置用箭头表示。具体实施方式园艺种与野生种通常情况下园艺种月季为4倍体(4x)，四季开花。与此相对，野生种 蔷薇通常为2倍体(2x)， 一季开花。园艺种月季被分类为杂交香水月季、丰花月季、微型月季，通常情况 下，任一种均在纯合子中含有插入了转座子的KSN基因。即本专利技术中所述 的园艺种月季是指在纯合子中含有插入了转座子的KSN基因的月季。另一方面，作为野生种蔷薇在日本自生的蔷薇有野蔷薇、先叶蔷薇、 玫瑰、刺蔷薇、剌玫蔷薇、大富士蔷薇、光叶蔷薇、山照叶野蔷薇、山蔷薇、硕苞蔷薇、八重山野蔷薇(Rosa bracteata)、金樱子、山椒蔷薇、高 岭蔷薇、多花蔷薇、森蔷薇(Rosa jasminoides)、富士蔷薇(Rosa fujis anensis)、 R. luciae var. onoei (Makino) Momiyama、或都蔷薇(Rosa paniculigera)等，通常情况下在纯合子中含有未插入转座子的KSN基因。 即本专利技术中所述的野生种蔷薇，是指在纯合子中含有未插入转座子的KSN基 因的蔷薇。 指标基因在本专利技术的方法中，作为指标基因，(1) 指标基因在园艺种月季中一定存在，在天然的野生种蔷薇中不存在。(2) 园艺种月季为4倍体(4x)，作为杂交指标的基因，在4条相同染色 体中需在至少3条中存在，优选在4条相同染色体中全部存在。园艺种月季 为4倍体(4x)，另一方面，天然的野生种蔷薇为2倍体(2x)。因此，由园 艺种月季产生的配子通常为2x，野生种蔷薇时为x，它们杂交的结果产生的 杂种为3倍体(3x)。由此可见，杂交的指标基因，在园艺种月季的相同基 因中，需在至少3条中存在，但考虑到不能否定由园艺种月季不均匀减数分 裂产生l倍体(x)配子的可能性，为了准确地检验，优选指标基因在全部4 条相同的染色体中存在。(3) 与指标基因碱基序列的部分序列相同的序列，在染色体的其他部分 不存在。为了检验被检植物中是否存在指标基因，通常需要扩增该基因，因此 使用与耙基因的部分互补的一对引物的PCR法是方便的。此时，与该引物杂 交的序列如果在靶基因以外存在，那么即使是原来的靶基因不存在的情况 ，也可得到可判断该基因存在的结果。因此，该要素在与引物设计的关联 上非常重要。具体的指标基因作为满足上述要素的基因，可例举插入转座子的KSN基因。现已证明 作为与月季的四季幵花有关的基因而报道的KSN基因(日本公开公报2006-1 49202)，在野生种中作为编码519个氨基酸的完整基因而存在，而在园艺种中在内含子部分插入了约9kb的转座子。即该转座子在野生种中不存在， 在园艺种中一定存在，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其特征在于，在检验作为被检对象的野生种蔷薇与园艺种月季是否发生杂交的方法中，分析在该作为被检对象的野生种蔷薇中是否存在作为指标的包含转座子的ＫＳＮ基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-3-23 077882/20071.一种方法，其特征在于，在检验作为被检对象的野生种蔷薇与园艺种月季是否发生杂交的方法中，分析在该作为被检对象的野生种蔷薇中是否存在作为指标的包含转座子的KSN基因。2. 根据权利要求l所述的方法，如果在作为被检对象的野生种蔷薇中 不存在作为指标的包含转座子的KSN基因，则判断作为被检对象的野生种蔷 薇与园艺种月季未发生杂交。3. 根据权利要求l所述的方法，如果在作为被检对象的野生种蔷薇中 存在作为指标的包含转座子的KSN基因，则判断作为被检对象的野生种蔷薇 与园艺种月季发生了杂交。4. 根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，母本为野生种蔷薇 ，父本为园艺种月季。5. 根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其中，所述园艺种月季是 导入了基因的月季。6. 根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，所述基因是与花色 相关的基因。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述与花色相关的基因是来自 堇菜科三色堇的类黄酮3， ，5，-羟基化酶基因。8. 根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，所述指标基因的检 测通过该基因的核酸的杂交来进行。9. 根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，所述检测通过PCR 特异性扩增来进行。10. 根据权利要求9所述的方法，其中，采用正向引物CATATTATGGCA TAGGGTGTGGC (序...

【专利技术属性】
技术研发人员：中村典子，水谷正子，田中良和，
申请(专利权)人：国际花卉开发有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]