表层嵌合体（ｓｕｒｆａｃｅ　ｃｈｉｍｅｒａ）转基因植物的培育方法技术

本发明专利技术培育出导入基因仅在一部分细胞、例如花瓣的Ｌ１层的细胞等中存在，而在其他细胞、例如花粉细胞、胚珠细胞等的生殖细胞中不存在的月季。本发明专利技术的月季即使与其他月季杂交，导入基因也不会向其他月季转移，所以，可完全否定导入基因扩散的可能性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供培育仅在一部分细胞中具有导入基因的嵌合基因重组植物 的方法。賴默由多个遗传上不同的细胞群组成的个体称作嵌合体。植物的嵌合体从 其结构上可分为周缘嵌合体、部分嵌合体及扇形嵌合体，例如除嫁接外， 可通过由突发的或放射线照射引起的体细胞突变、由药剂处理引起的染色 体加倍来制备。扇形嵌合体(sectorial chimera)是植物重叠结构引起的非结构性嵌 合体，由生长点上非结构性混合存在的突变细胞的增殖所产生。即一个组 织层自身即是嵌合体，多在花，叶，茎等的器官呈现不同颜色的条纹。扇形 嵌合体通常不稳定、大多易消失，但也有极少发展成周缘嵌合体。周缘嵌合体(periclinal chimera)是指由植物的组织层结构引起的 结构性嵌合体，是扇形嵌合体发展、 一个细胞层完全被突变细胞取代的状 态。为周缘嵌合体时， 一个组织层自身均匀，不是嵌合体。己知周缘嵌合 体稳定，消失的几率小。植物的细胞组织基本上由3个细胞层构成，从外 侧开始具有第l层(Ll)、第2层(L2)、第3层(L3)的组织层结构。由生长点的2层原套(tunica)产生的组织层为Ll和L2，由原体(c orpiis)产生的组织层为L3。在几乎所有的植物种中，表皮均由Ll层生成， L2层与生殖细胞系统有关。上述这些每个细胞层都具有不同性质的周缘嵌 合体很多在园艺上都很重要、且产业价值高，但通过突发的方法、或通过 放射线照射、药剂处理等人工诱变的方法得到周缘嵌合体的概率极低。在将外源基因导入植物体时，人工培育出仅在一部分细胞中具有导入基因的嵌合体植物非常不容易。到目前为止，己有通过使用基因枪的方法向玉米的未成熟胚中导入基因，从而培育出仅在生殖细胞或L2细胞层中具 有导入基因的嵌合体植物的例子(日本特表平10 — 503374号公报)。但是， 通过农杆菌介导而导入基因时，培育嵌合体植物就更加困难。通过农杆菌 介导而导入基因的方法中，以通过标记基因表达的抗药性等的性状为指标， 筛选导入了基因的单一细胞，由该单一的基因导入细胞得到一个转化体植 物个体。因此，通常得到的基因重组植物由可遗传的单一细胞组成，是在所有 的细胞中具有导入基因的植物。即使得到了仅在一部分细胞中具有外源基 因的植物(嵌合体植物)，那也是偶然的结果，利用现代技术进行仅在植物 体的特定部分的细胞中导入基因的控制非常困难。而且认为，即使是偶然 所得，形成如前所述的仅在一部分细胞层中具有基因的周缘嵌合体的概率 也极低。在筛选基因导入细胞的过程中，有时虽出现仅在其一部分细胞中导入 了外源基因的嵌合细胞团或嵌合植物体，但此时通过全细胞层形成嵌合体、 或一个组织层自身形成嵌合体，而不是完整的周缘嵌合体(仅在特定的细 胞层中导入了外源基因，其细胞层自身均匀)。至今为止，培育出完整的周 缘嵌合体转基因植物、并将其用分子生物学的方法证明的例子极少。到目 前为止，虽已报道了以下实例，即发现了通过使用含有rol基因和脱离因 子的载体，可培育出周缘嵌合体(日本特开2002-315460号)，但此时为L 3层的周缘嵌合体。在基因重组植物中，被惨入染色体中的导入基因根据孟德尔定律可稳 定传递给其后代。通过将这些基因重组植物作为杂交亲本使用，利用来自 导入基因的性状进一步培育出新品种。而且对于基因重组植物，担心的是其对生态系统(环境)的影响(导 入基因向自然界的扩散等)。作为用于防止基因由基因重组植物向非转化 体、野生植物扩散的技术，已知有(1)母系遗传的利用、(2)雄性不育的 利用、(3)不育种子的利用等。母系遗传的利用是指通过在不传入花粉细胞的叶绿体的基因组中导入外源基因，从而防止通过花粉的基因扩散的方 法。雄性不育的利用是指或抑制花粉形成、或使花粉不具有生殖能力的方 法，可由此进行遗传隔离。例如有使用雄性生殖器官特异性表达的启动子, 组织特异性地制作有害的基因产物，从而抑制花粉形成的方法等。不育种 子的利用是指通过直接抑制基因重组植物的种子形成，从而防止杂交或种 子扩散这两者的方法，不能进行自留种的"终止子技术"等即为此方法。假设只要可培育出生殖细胞中不携带导入基因的基因重组植物，即可 在以其重组植物作为花粉亲本时、或作为种子亲本时的任一情况下，完全 排出由杂交所导致的导入基因扩散的可能性。此结果对于将基因重组植物 进行野外栽培、或进行产业利用的人来说，可减轻用于基因重组植物栽培 的手续所造成的负担。此手续在日本国内是基于"通过规范基因重组生物 等的使用等以确保生物多样性的相关法律(卡塔赫纳法)"的生物多样性影 响评价等，在其他国家也有基于同样的法律的评价。专利文献1日本特表平10—503374号公报 专利文献2 日本特开2002-315460号 专利文献3 USP 5480789 专利文献4 W0 2005/017147 专利文献5 PCT/JP96/00348非专利文献l Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 1994非专利文献2 Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967， 1991 非专利文献3 Fujiwara et al. Plant J. 16 421-431， 1998 非专利文献4 Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37， 45-59199
技术实现思路
因此，本专利技术提供导入基因仅在植物体的一部分细胞中存在，例如在生殖细胞中不存在的基因导入的月季等的花卉植物。本专利技术者为解决上述课题进行了种种研究，结果发现将外源基因通过根癌农杆菌介导而导入花卉植物时，有时再生的花卉植物会形成嵌合体植物。而且发现，通过从中选择周缘嵌合体的植物，可得到目的基因重组花卉植物，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供外源基因在一部分细胞中存在，而在其他细胞中不存在的月季等的花卉植物。优选所述一部分细胞构成一部分的细胞层。例如，上述其他细胞例如为花粉或胚珠。作为更加具体的例子，所述一部分细胞层为Ll层、或L1层和L3层。作为外源基因，是与类黄酮的合成有关的基因，其中可例举与花色素苷的合成有关的基因等与花色有关的基因。花卉植物为月季时，外源基因中，例如来自堇菜科植物的类黄酮3'，5'—羟基化酶基因、来自玄参科植物的芳香族酰基转移酶基因非常重要。所述堇菜科植物例如为堇菜科三色堇，所述玄参科植物例如为玄参科蓝猪耳。所述月季例如为月季品种WKS82等的杂交香水月季、丰花月季、微型月季。本专利技术的月季根据导入基因的效果，例如与基因导入前的月季相比，花色向蓝色方向改变。花卉植物为康乃馨时，外源基因、例如所述外源基因是在来自金鱼草的查耳酮合成酶基因的启动子控制下的来自一串红的类黄酮3'、 5'-羟基化酶基因cDNA、来自矮牵牛的二氢黄酮醇4-还原酶的染色基因、来自康乃馨的花色素合成酶基因中的一个 多个基因。所述康乃馨为大轮品系或中小轮品系。本专利技术的康乃馨根据导入基因的效果，例如，与基因导入前的康乃馨相比，花色向蓝色方向改变。但是，外源基因不限于上述基因，也可以为在广泛的色素合成体系中发挥功能的基因、例如类黄酮合成体系中发挥功能的基因。此外，外源基因也可为如GFP基因、NPT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花卉植物，其特征在于，一部分细胞中含有外源基因，而其他细胞中不含有外源基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：户上纯一，叶卡捷琳娜莫拉多娃，
申请(专利权)人：国际花卉开发有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]