一种ＫＡＩ１基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种ＫＡＩ１基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。本发明专利技术还提供了一种ＫＡＩ１基因原位杂交检测方法。另外，本发明专利技术还提供了试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种KAM基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说关于一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
技术介绍
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告， “认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战 失败的几个因素是1、肿瘤细胞异质性；2、肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善 等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本专利技术人在研究中发现，导致 癌症死亡率不降的另二个重要原因是1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不 清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性 癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一临床概念值得认 真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿 瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可 能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和 单独的病灶。临床上已证实一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他 部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶 时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。KAIl基因位于染色体llpll. 2，编码由267个氨基酸组成的KAIl蛋白(⑶82)， KAI1/CD82蛋白为细胞膜糖蛋白，属于TM4SF成员，它对肿瘤转移的抑制作用可能源于其对 细胞运动、转移和增生的影响，也与调节细胞的黏着有关。KAI 1蛋白和其他TM4SF分子可 与整联蛋白形成复合体，从而调节整联蛋白的黏着功能，并影响蛋白的介导的细胞转移。现 已证实，KAIl基因和肝癌的侵袭转移呈负相关，KAIlmRNA的表达下降可增加肝癌的侵袭转 移潜能，无肝内转移的肝细胞癌中KAIl表达明显高于有肝内转移的病例，Adadci等研究发 现KAIl阳性肝癌患者的生存率明显高于KAIl阴性者。同时有人认为KAIl基因的高表达 可能是某些低转移潜能肺癌的特征，KAIl表达可作为评估非小细胞肺癌患者预后的指标。 Hisashiyama等同样认为KAIl/⑶82在非小细胞肺癌中的表达是判断其预后的一个指标， 他们把患者分为KAI 1表达阳性、减少、阴性3组，3年生存率分别为86%，56%和66%， 后两组与表达阳性组比较有显著差异。在其他多种肿瘤如前列腺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌 中同样发现KAIl基因下调可以作为侵袭转移和不良预后的标志。KAIl基因，NM_002231, 1715bp, mRNA. llpll. 2，cds249··· 1052bp。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。本专利技术采用核酸原位杂交技术检测KAIl基因，对癌细胞早期 转移、复发及诊疗后的病理演变过程判定有重要的临床意义。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种KAIl基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本专利技术的再一的目的是，提供一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒。本专利技术的另一的目的是，提供一种KAIl基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物 中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌症是肝癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食道癌。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本专利技术的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1).将待测标本放入反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；5).仪器自动弃去液体，自动清洗；6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本专利技术优点在于1、本专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本专利技术的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有 显著不同。本专利技术可以在基因水平上检测KAIl基因异常表达，在影像医学检查未发现占位 性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基 因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预 测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌 症恶疾。附图说明图1是本专利技术实施例中肝癌转移病人KAIl基因表达图片。图2是本专利技术实施例中非小细胞肺癌转移病人KAIl基因表达图片。图3是本专利技术实施例中前列腺癌转移病人KAIl基因表达图片。图4是本专利技术实施例中卵巢癌转移病人KAIl基因表达图片。图5是本专利技术实施例中乳腺癌转移病人KAIl基因表达图片。图6是本专利技术实施例中食道癌转移病人KAIl基因表达图片。图7是本专利技术实施例中正常人KAIl基因表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＫＡＩ１基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】
一种KAI1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的癌症是肝癌、非小细胞肺癌、前列 腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食道癌。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或 非放射性标记物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：裘建英，张云福，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31