一种ＥＧＦＲ基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种ＥＧＦＲ表皮生长因子受体基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。本发明专利技术还提供了一种ＥＧＦＲ基因原位杂交检测方法。另外，本发明专利技术还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说关于一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
技术介绍
癌症也叫恶性肿瘤，肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常 增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生 细胞取代它，以维持机体功能，人体绝大部分细胞都可以增生，但这种增生是有限度的，而 癌细胞的增生则是无止境的，这使患者体内的营养物质被大量消耗。同时，癌细胞还能释放 出多种毒素，使人体产生一系列症状，晚期时它转移到全身各处生长繁殖，最后导致人体消 瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，器官功能衰竭而死亡。EGFR表皮生长因子受体，在生理状态下是细胞生长的调节因子，与其配体如EGF、 TGF-α结合后发挥其生理效应，可启动细胞生长周期，即通过一系列细胞内传递体将生长 信号传导至核内引起细胞的生长反应，调节细胞的分裂、分化和增殖。在恶性肿瘤中，EGFR 过度表达，持续向细胞内传递分裂增殖信号，干扰细胞分化的正常调控状态，引起细胞持 续增殖，发生恶性转化。细胞系的实验研究对成釉细胞瘤细胞表面的表皮生长因子受体 (ECFR)和C-erbB-2等生长因子受体进行了检测，发现肿瘤细胞表面的EGFR和C_erbB_2的 阳性率分别为(42. 20士3. 42) %和(57. 03士 5. 06) % 0肿瘤生长和发展过程中，体内微环境 对肿瘤细胞的分裂增殖具有重要意义，微环境和肿瘤细胞之间可通过自分泌、旁分泌和内 分泌等方式产生的多种信号因子，单独或联合调控肿瘤细胞的增殖生长。C-erbB-2与EGFR 的结构相似，已有实验证明在肺癌和黑色素瘤患者中EGFR阳性细胞的转移和继发生长能 力都强于EGFR阴性的细胞亚群。实验中近半数的肿瘤细胞表面存在EGFR和C_erbB_2等 生长因子受体，推测成釉细胞瘤本身分泌的生长因子和细胞表面的生长因子受体可能在肿 瘤细胞体内增殖和侵袭等过程中起重要作用。有大量文献报道EGFR基因各种癌症发病有 关，EGFR基因表达变化明显增加。在肺癌、胰腺癌和结直肠癌等多种肿瘤患者的外周血中 可以检测到表皮生长因子受体(EGFR)的表达。肺癌和良性疾病之间外周血血清EGFR水平 无差别，但在伴有淋巴结转移的肺癌中的表达与无转移组之间差别显著，血清EGFR水平可 作为肺癌淋巴结转移的指标。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至 今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到基因水平的早期预测诊断。采用核酸原位杂交技术检测Egfr基因的表达量， 对临床各种类型癌症的早期基因水平的诊断有非常重要的临床意义。EGFR基因序列号 NM_005228，5616bp，mRNA，7pl2 CDS 247......3879bp。本专利技术的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技 术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补 核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种EGFR基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本专利技术的再一的目的是，提供一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒。本专利技术的另一的目的是，提供一种EGFR基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述 的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的疾病是肾癌，胰腺癌，结直肠癌或肺癌。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种EGFR基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的 时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。本专利技术的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1).将待测标本放入反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )5).仪器自动弃去液体，自动清洗；6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本专利技术优点在于1、本专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本专利技术的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程，以及用于癌症预防医 学的检测和筛选工具。本专利技术的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像 医学检查有显著不同。本专利技术可以在基因水平上检测EGFR异常表达，在影像医学检查及其 它检查未发现占位性癌症病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能 及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这样 才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。附图说明图1是本专利技术实施例中肾癌症病人EGFR基因表达图片。图2是本专利技术实施例中胰腺癌症病人EGFR基因表达图片。图3是本专利技术实施例中肺癌症病人EGFR基因表达图片。图4是本专利技术实施例中正常人EGFR基因表达图片。具体实施方式下面结合附图对本专利技术具体实施方式作详细说明。实施例1一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下消化液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体保护液100 μ 1/管1管/盒无色透明液体预杂交液1300 μ 1/ ,f 2管/盒无色透明液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＥＧＦＲ基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】
一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或31P 中的一种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]