促红细胞生成素融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及重组融合蛋白，其中促红细胞生成素（ＥＰＯ）通过其Ｃ－末端与Ｆｃ片段连接，并且其中所述重组融合蛋白在该融合蛋白的伯胺处被进一步氨甲酰化。更具体而言，本发明专利技术涉及氨甲酰化ＥＰＯ－Ｆｃ融合蛋白，其中所述融合蛋白的至少一个、优选两个或更多个赖氨酸胺残基和／或Ｎ－末端氨基酸被氨甲酰化。与未修饰的ＥＰＯ－Ｆｃ融合蛋白相比，本发明专利技术的氨甲酰化ＥＰＯ－Ｆｃ融合蛋白具有降低的造血活性，而其组织再生活性，即神经细胞再生活性保持不变或甚至得到增强。本发明专利技术还涉及制造这样的融合蛋白的方法以及包含所述融合蛋白的药物组合物，并且涉及这些融合蛋白及药物组合物在医疗上的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及其中促红细胞生成素(EPO)与蛋白载体尤其是与抗体或 抗体片段例如Fc片段连接的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白被进 一步氨甲酰化。本专利技术还涉及所述融合蛋白的制造方法和含有所述融合 蛋白的药物组合物，以及所述融合蛋白和药物组合物在医疗上的应用。
技术介绍
促红细胞生成素(EPO)是一种公知的糖蛋白，最初因其对骨髓的激素 性影响和参与成熟血红细胞的生长与发育而被鉴定。除这种造血活性之 外，最近已发现EPO还在许多组织中作为有效的、局部生成的改善代谢 应激的分子而起作用。EPO的组织保护活性通过与促红细胞生成素受体 的相互作用而介导。例如，在脑部，EPO和它的受体于局部产生，受到 代谢应激物的调控，并提供神经保护和抗炎的功能(Doggrdl， SA. (2004) Expert Opin Investig Drugs; 13(11): 1517-9)。在脊髓中，EPO提供的有益 效果包括抑制神经元、少突胶质细胞和内皮细胞的凋亡和坏死，减少空 化，降低脂质过氧化、动员内皮祖细胞，促进血管发生和恢复血管的自 我调节(Gorio， A.等(2002) Proc Natl Acad Sci USA; 99(14):9450-5; Leist M.(2004) Science; 305(5681 ):239-42)。已经证实，EPO通过核因子(NF)-k B通路的成员的调控，以及由janus激酶-2/信号转导物和转录5系统的活 化剂而进行信号转导(Gorio A.(2005) Neurosurgery; 56(4):821-7; Grasso G(2005) Neurosurgery; 56(4):821-7)。通过化学修饰，即，EPO的赖氨酸和/或N-末端氨基酸的至少一个伯 胺基的氨甲酰化，与未经氨甲酰化的EPO相比，该细胞因子的造血活性 显著降低，同时其组织保护活性，即其神经细胞再生活性保持基本不变 或者甚至得到增强。WO 2006/014466和WO 2006/002646公开了用于各种医学适应症的 氨甲酰化EPO的制造和应用。由于EPO的血清半衰期相对较短，并且本领域公知将免疫球蛋白恒 定区与非免疫球蛋白的蛋白融合可显著地延长所述非免疫球蛋白的蛋白 的血清半衰期，因此已有数种方法被用于将免疫球蛋白片段与EPO连接。 例如，WO 99/02709揭示了包含EPO和免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白的 生产与应用，其中EPO-Fc融合蛋白的体内半衰期与天然存在的EPO相 比得到增加。从WO2005/063808可知，通过特定氨基酸的突变、缺失或插入可进 一步改善EPO-Fc融合蛋白的药代动力学，g卩，延长血清半衰期并提高体 内效能。因此，对治疗疾病的需求是简化的且花费更低的EPO疗法，g口，需 要更低频率的EPO施用，其中理想的是EPO的组织再生活性(即神经细 胞再生活性)不变或甚至增强，而同时需要较少或甚至不需要EPO的造血 活性，因此将造血活性降低。这些疾病包括但不限于中枢神经系统(CNS) 和/或周围神经系统(PNS)的功能异常或损害，特别是包括与神经损伤相关 或由神经损伤引起的疾病，所述的神经损伤包括例如机械撞击后的物理 神经损坏。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是通过化学修饰(即，氨甲酰化沐改善与非 融合EPO蛋白相比具有延长的血清半衰期的已知EPO-Fc融合蛋白，从 而获得经修饰的EPO-Fc融合蛋白，该经修饰的EPO-Fc融合蛋白除了具 有延长的血清半衰期之外，与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比还具有减少 的造血活性，但仍具有不变的或者增强的再生活性。本专利技术所述的经修饰EPO-Fc融合蛋白适用于治疗中枢神经系统 (CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病或功能异常，包括由例如机械撞 击、热或辐射导致的神经物理损坏所引起的或相关的疾病。本专利技术的经 修饰EPO-Fc融合蛋白的优势特征之一是与用于相同目的的传统EPO或EPO-FC相比可施用更大治疗剂量，并且基本上不增加对造血系统即血球 计数的不利影响。相应地，本专利技术的一个目的是提供经修饰的重组EPO融合蛋白，其 中EPO与蛋白载体连接，特别是与免疫球蛋白或免疫球蛋白片段如Fc 片段连接，更特别是与IgG分子的Fc部分连接，并且其中所述重组融合 蛋白通过氨甲酰化被进一步修饰。本专利技术的另一个目的是提供所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的 制备方法。本专利技术的另一个目的提供包含所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白 的药物组合物。本专利技术的另一方面涉及所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白对于医 疗的应用。本专利技术的另一方面涉及包含所述氨甲酰化重组EPO-Fc融合蛋白的 药物组合物对于医疗的应用。从属权利要求进一步描述了本专利技术的特征，而本专利技术各实施方式是 独立权利要求的主题。附图说明图1显示了挫伤后的大鼠在施用本专利技术的氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白 后运动恢复的测定结果。纵座标-Beattie-Bresnahan-Basso(BBB)量表；横 坐标=在挫伤前、后选取的时间点；praeOP-挫伤前；第1组=以rhEPO 蛋白处理的动物(对照)；第2组-未处理的动物(安慰剂组)；第3组=以未 氨甲酰化的EPO-Fc融合蛋白处理的动物(比较组)；第4组=以氨甲酰化 的EPO-Fc融合蛋白处理的动物(实验组)；第5组=以甲泼尼龙处理的动 物(比较组)。图2显示了在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中，在EAE 进展的不同阶段通过确定EAE评分对氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白的效果 的评估结果。纵座标=实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)评分量表；横坐标=开始施用之后的天数；图2八=早期处理以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(测试组； 第1组)或PBS (对照组；第2组)处理的动物，施用在EAE诱发后第18天开始；图2B-中期处理以氨甲酰化EPO-FC融合蛋白(测试组；第3 组)或PBS(对照组；第4组)处理的动物，施用在EAE诱发后第28天开 始；图2C^免期处理以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(测试组；第5组)或PBS(对照组；第6组)处理的动物，施用在EAE诱发后第52天开始。小 鼠分组安排的详细信息见表2。图2A至2C显示了各组所用动物的平均 EAE评分。具体实施例方式本专利技术的第一实施方式提供了化学修饰(即氨甲酰化)的重组EPO-Fc 融合蛋白，其与未融合的EPO蛋白相比具有显著延长的血清半衰期，同 时，与未修饰的EPO-Fc融合蛋白相比具有降低的造血活性，此外，其神 经细胞再生活性与未修饰的EPO或EPO Fc融合蛋白的相应活性相比不 变甚至得到改善。此处所用"EPO-Fc融合蛋白"是指包含EPO部分和Fc部分的蛋白。 此处所用"EPO部分"包含人或其它来源的全长野生型或天然存在的促红 细胞生成素，以及促红细胞生成素样分子，所述促红细胞生成素样分子 包括促红细胞生成素生物活性片段、促红细胞生成素的类似物、变体、 突变体和衍生物。此处所用"Fc部分"包含来源于免疫球蛋白(优选来源于 人免疫球蛋白)恒定区的域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体 或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG，艮卩，IgGl、 lgG2、 lgG3和lgG4等亚类，以及其它类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ＥＰＯ融合蛋白，所述蛋白与ＥＰＯ相比在体内具有改善的生理学半衰期和降低的造血活性，并进一步具有体内神经再生活性，所述蛋白的特征在于它包含人ＩｇＧ分子的Ｆｃ部分和促红细胞生成素（ＥＰＯ）部分、优选人促红细胞生成素部分，其中所述Ｆｃ部分通过其Ｎ－末端与所述ＥＰＯ部分的Ｃ－末端直接连接，并且其中所述融合蛋白通过氨甲酰化被修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特维克，托马斯赫梅特斯贝格，海因茨雷德尔，
申请(专利权)人：波利门科学生物免疫研究有限公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]