活疫苗及生产方法技术

本发明专利技术涉及一种从不同来源分离病毒以及在无血清Ｖｅｒｏ细胞培养物中生产活减毒流感疫苗的简单有效的方法，其中所述生产在最小化或预防所述病毒的表面蛋白由于适应性选择而发生变化的条件下进行。本方法不要求对从所述细胞培养物收获的含病毒的上清液进行纯化，也不要求对所述病毒进行温育后处理以进行ＨＡ活化。本发明专利技术还涉及Ａ型和Ｂ型流感原株候选物以及由其制造的疫苗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于病毒学和疫苗发展的领域，涉及生产病毒疫苗的改良方法以及用该方法可获得的疫苗，所述病毒疫苗尤其是完整病毒疫苗，最好是减毒活疫苗。
技术介绍
流感血凝素(HA)抗原是宿主对病毒的保护性免疫反应的主要靶。回收新病毒分离物的一般实践涉及从鼻拭子和喉拭子或从类似来源回收，然后在含胚的鸡蛋中培养所述分离物。病毒适应其鸡蛋宿主，因此可以在鸡蛋中进行所述病毒的大规模生产。然而，所述涉及用含胚鸡蛋生产流感疫苗的常规方法异常麻烦，涉及每周处理成千上万个鸡蛋，以及大规模纯化从尿囊液获得的病毒悬浮液以保证不含鸡蛋蛋白。使用鸡胚生产病毒的另一个缺点是该支持物非常倾向于选择在抗原特异性上与野生型病毒不同的病毒变异体，并且有时导致病毒由于表型改变而不适用于生产疫苗，所述表型改变包括，例如，免疫原性显著降低。因此，本领域内已经进行许多努力，利用标准组织培养技术，用已经建立的哺乳动物细胞系如MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞或Vero(非洲绿猴肾)细胞进行病毒生产，尤其是流感病毒的生产。在组织细胞培养物中培养流感株的困难之一是需要对宿主中的流感血凝素进行蛋白水解切割。切割病毒HA前体成为HA1和HA2亚片段虽然对于装配病毒元件形成完整病毒粒不是必要的，但却是赋予病毒粒感染性(即使其能够感染新的细胞)所必需的。已经报道(如Lazarowitz等，“通过蛋白水解切割血凝素多肽增强B型流感病毒的感染性”，Virology，68440-454，1975)通过在组织培养物的培养基中加入蛋白酶如胰蛋白酶，可以克服几个A型流感病毒株在标准细胞培养物中的有限复制。然而，在某些情况下，例如在使用Vero细胞的情况下，这仍然是有困难的。Kaverian和Webster(J Virol 69/42700-2703，1995)报道在Vero细胞培养物中，培养基中的胰蛋白酶活性从温育开始就快速降低，导致由于无法产生足够数量的感染性病毒粒而不能在培养基中积累病毒，但这种现象在MDCK、猪肾或恒河猴肾细胞培养物中不是那么明显。他们得出结论从Vero细胞中释放出一种胰蛋白酶抑制因子。他们进一步显示通过重复加入胰蛋白酶，可以恢复病毒复制，并使病毒复制维持多个循环，导致更好的病毒产量。US5,753,489报道另一种有效生产疫苗的方法，其中使用无血清培养基在多种不同哺乳动物细胞系(包括MDCK细胞和Vero细胞)中增殖病毒。该文献公开的方法包括在无血清培养基中培养脊椎动物细胞、用病毒感染所述细胞培养物、温育病毒感染的所述细胞培养物、取出包含病毒的一部分培养基并用蛋白酶接触该部分、然后在该部分中加入蛋白酶抑制剂并将该部分返回所述细胞培养物。在该文献中，优选在第一个容器中提供培养、感染和温育的步骤，在第二个容器中进行接触胰蛋白酶和加入抑制剂的步骤，所述第二个容器与第一个容器形成循环，以便所述步骤能够在闭合循环内进行。该系统允许在培养物中以比细胞所能够通常承受的浓度更高的浓度使用胰蛋白酶或其它蛋白水解酶。EP 0870508报道一种生产病毒抗原疫苗的方法，该方法包括用病毒感染一种动物细胞系(可选地是Vero细胞系)，在所述细胞培养物中繁殖病毒，在病毒增殖结束前不久在所述细胞培养物中加入核酸酶消化从裂解的宿主细胞释放到培养基中的核酸物质，然后收获所述病毒，通过提取获取病毒抗原，以制造病毒抗原疫苗。该方法没有提到用于增殖病毒的营养培养基种类以及蛋白酶的加入，而加入蛋白酶是最后加工流感病毒血凝素获得感染性病毒所需的。该方法还要求各种纯化步骤以提供现成的疫苗制备物。然而，已知宿主支持物的性质和用于增殖病毒的营养培养基的组成可以显著影响由此获得的病毒后代的免疫原性和抗原性。尤其是含血清的培养基不仅降低病毒后代的抗原性，而且还降低培养基中的蛋白酶活性，由此抑制病毒成熟，并随后要求昂贵的纯化步骤。专利技术简述本专利技术克服在先技术的缺点。本专利技术涉及一种简单有效的方法，该方法用于从各种来源分离病毒，并在最小化或完全防止由于适应性选择而引起的所述病毒表面抗原改变的条件下，生产用作疫苗(尤其是活减毒流感疫苗)的病毒后代。本专利技术的另一个目标是提供生产病毒(尤其是流感病毒)的方法，所述方法产生选择性凝集人红细胞而不凝集鸡红细胞的病毒后代，并且所述病毒后代的抗原特性最好与最初接种的病毒株(如初级临床野生型分离物)的抗原特性相同。在一个优选实施方案中，所繁殖病毒的HA基因以及可选NA基因的核酸序列与最初接种的株(如流行株、感染患者的初级临床分离物)的所述核酸序列相同。本专利技术的再一个目标是提供在单一步骤方法中有效生产完整病毒疫苗(尤其是活减毒疫苗)的方法，所述方法在通过离心从细胞培养物上清液收获病毒悬浮液后不需要任何层析或其它纯化步骤，尤其不需要蛋白分离或纯化步骤。本专利技术的又一个目标是提供减毒、冷适应和温度敏感的A型和B型流感病毒株以及用它们制备的疫苗。附图简述附图说明图1是一个示意图，说明在Vero细胞培养物上清液中胰蛋白酶失活随时间变化的过程。图2是一个示意图，说明在MDCK细胞培养物上清液中胰蛋白酶失活随时间变化的过程。专利技术详述使用含胚卵、MDCK和Vero细胞的比较试验清楚地证明最初接种的病毒有可能在这些支持物中任何一种上生长时发生抗原性改变。我们的试验证实在无血清培养基内Vero细胞上培养的流感病毒株发生最少改变或不发生改变。此外，证实当A型流感病毒(至少H3N2亚型株)在无血清和无蛋白培养基内的Vero细胞上生长时表现选择性凝集人红细胞，但不凝集鸡红细胞。此外，它们不能在蛋内生长。首次表明与在MDCK细胞或蛋上培养的病毒相比，这些Vero培养的病毒可能与对应临床分离物的野生型病毒更相似。事实上，从鼻拭子获取的野生型分离物的HA基因和NA基因与分别在Vero细胞和MDCK细胞上培养的同样病毒相比，揭示MDCK培养的病毒的HA或NA相对于拭子分离物的HA或NA发生改变，或相对于Vero培养的病毒发生改变，或相对于拭子分离物和Vero培养的病毒都发生改变。此外，用Vero或MDCK培养的野生型病毒免疫雪貂的试验数据指出Vero培养的病毒比MDCK培养的病毒的毒力强得多。另外，对猕猴进行动物试验测试的Vero培养的病毒的免疫原性显著优于在MDCK细胞或卵上培养的病毒的免疫原性。这些发现综合在一起为下面的假说提供强有力的证据根据下文更详细描述的本专利技术用于扩增和增殖病毒的方法产生与最初接种(如野生型)病毒相比未改变或仅发生很小程度修饰的病毒。本专利技术的病毒扩增方法不仅避免抗原改变，而且异常简单，使其非常适于大规模工业化疫苗生产。其它试验已经显示胰蛋白酶(或胰蛋白酶原)的来源可能是影响感染性病毒粒总产量的另外一个因素。事实上，虽然本领域内已知的方法(如Kaverin和Webster，J Virol 69/42700-2703，1995；或US5,753,489)或者重复加入胰蛋白酶(Kaverin和Webster)，或者使用高胰蛋白酶浓度(US5,753,489)，但依照本专利技术的方法仅使用在先技术中报道的一半或更低胰蛋白酶浓度。此外，在温育感染宿主细胞开始前或开始时，在细胞培养物培养基中一次性加入低至0.5-10μg/ml、优选2-5μg/ml的胰蛋白酶足以达到最佳感染性病毒滴度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产完整病毒疫苗的方法，所述完整病毒疫苗最好是一种减毒活疫苗，所述方法包括下面步骤：ａ）用一种所需病毒感染非洲绿猴肾（Ｖｅｒｏ）细胞，其中所述Ｖｅｒｏ细胞已经在无血清培养基中培养并从中分离，所述无血清培养基也不含非血清蛋白；ｂ）将所述感染细胞与一种合适的无血清细胞培养基混合，所述无血清细胞培养基除蛋白酶和核酸酶外也不含非血清蛋白；然后ｃ）在所述蛋白酶和所述核酸酶的存在下温育所述细胞，使得生产传染性病毒并同时消化释放到细胞培养基中的核酸；ｄ）通过收集离心所述细胞培养物获得的包含病毒的上清液，收获传染性病毒；然后ｅ）如下制备其疫苗：用选自以下的至少一种加工步骤处理所述包含病毒的上清液：过滤、浓缩、冰冻、冻干和加入稳定剂使之稳定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H卡廷格尔，A埃戈洛夫，B费尔科，J罗马诺瓦，D卡廷格尔，
申请(专利权)人：波利门科学生物免疫研究有限公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]