本发明专利技术公开了一种检测人类ＤＮＡ修复酶类基因多态性的玻璃基因芯片，包括经醛基化处理的玻璃片和阵列式排布分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针、对照与空白的点涂层，所述点涂层是６条不同位点的ＤＮＡ修复酶基因特异性检测探针，１条阳性对照，３条阴性对照和空白点样液对照，本发明专利技术检测探针与对照探针均以ｐｏｌｙ（ｄＴ）１５作为连接臂，并在探针的５’端加入带氨基的六碳基团。本发明专利技术还公开了人全血ＤＮＡ样品扩增的上下游引物设计。本发明专利技术的芯片可快速、高效对人类ＤＮＡ修复酶ＸＲＣＣ１Ａｒｇ１９４Ｔｒｐ、Ａｒｇ３９９Ｇｌｎ位点和ＸＰＤＡｓｐ３１２Ａｓｎ位点基因多态性进行同步检测，了解机体对内外源因素引起的ＤＮＡ损伤的修复能力，对判断个体罹患恶性肿瘤的风险和指导肿瘤病人选择合适的化疗药物、实施个体化治疗具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人类DNA修复酶基因多态性的芯片及其制备，尤其涉及一种能同 时检测XRCCl Argl94Trp、Arg399Gln位点和XPD Asp312Asn位点基因多态性的玻璃基因芯 片及其制备方法。
技术介绍
基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列 固定于固相支持物上，然后与待测的标记的核酸样品按碱基配对原理进行杂交，再经过一 定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号进行数据分析和处 理，从而迅速得出所要的信息。与传统的杂交技术相比，该技术具有微型化、高灵敏性、高度 平行性，和高速性的显著特点。其发展速度和其中所运用的技术令人瞩目。迄今为止，已在 基因表达检测，基因突变检测，单核苷酸多态性和DNA序列测定等方面展开了广泛的研究 和应用。机体细胞DNA遭受环境理化因子(如电离辐射和化学物质)或由正常和异常细胞 代谢产物(如氧自由基)的袭击，可引起不同类型的损伤碱基和脱氧核糖变化、DNA链间 交联和(或)DNA-蛋白质交联、DNA单链和双链的断裂。DNA修复则是对损伤的主要生物学 反应，促使DNA中损伤的、不合适的或错配的碱基恢复本来的生物化学过程，维持遗传物质 稳定。机体DNA修复能力差者更易于罹患恶性肿瘤等严重疾病以及对钼类化疗药物更为敏 感。研究表明，体内DNA修复酶类活性受基因表达所控制，并且与基因序列上极小的遗传差 异即单核苷酸多态性有关。因此了解机体DNA修复酶类基因的遗传变异，对DNA损伤修复 能力的遗传风险进行科学、客观地评估具有重要意义。XRCCl是一种重要的DNA修复基因，对维持基因组稳定具有关键作用。XRCCl蛋 白通过与聚合酶β、DNA连接酶III和多聚ADP核糖聚合酶形成复合物(PARP)，参与因电 离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复。研究发现在XRCC1194密码子和 399密码子处具有2个单核苷酸多态，分别引起C — T和A — G碱基突变，导致相应氨基酸 残基的改变Argl94Trp和Arg399Gln。这些突变使XRCCl在人体形成3种基因型野生 型、突变型和杂合型。Argl94Trp发生在与DNApol β和PARP作用域之间的连接区，而Arg 399Gln突变是在COOH端与PARP作用域，即BRCTl域。由于发生在多蛋白复合体的蛋白质 交界面上残基与活性中心相关残基在酶功能中有一定作用，这些多态性可能会导致蛋白质 活性的改变。XPD基因产物是一个由760个氨基酸构成的蛋白质，该蛋白具有ATP依赖的 5' -3' DNA解旋酶，参与NER和基因转录，XPD基因312密码子G —A碱基存在着遗传多 态性，可导致其产物具不同的生物学活性，使人群DNA损伤的修复能力存在明显的差异。目前对于基因多态性检测，已经建立的技术有，IDNA测序法PCR扩增包含突变位点的一段基因序列，利用DNA测序仪进行测序分 析，缺点是测序价格昂贵，只能逐个基因进行检测，不适合对多个基因同时进行检测。2聚合酶链-限制性长度多态性(PCR-RFLP)法目前最为常用，主要为采用PCR扩增包含突变位点的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切 酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异切位点，即由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。 此方法费用不高，但是操作步骤繁琐，费时费力。3聚合酶链-单链构象多态性(PCR-SSCP)法采用PCR扩增包含突变位点的DNA片段，变性后进行聚丙烯酰胺电泳，银染后观察结果。因其检测敏感，快速和所需装置简便 而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响，如温度，电 压，PAGE胶的浓度和交联度等，重复性较差。4 变个生的高效液才目色谱检 IlJ (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)法采用PCR扩增包含多态性位点的DNA片段，加热变性后缓慢复 性，将样品置于色谱仪的96孔板上，输入DNA序列，根据软件计算提示选择最佳运行温度， 在色谱图中判断不同的基因突变类型。此方法灵敏度较高，可以搜寻未知的SNP位点，但是 无法对已知SNP实现100%检出。然而，上述检测方法存在一个共同的缺点通量低，即一次检测反应仅能检出一种 基因一个位点的基因多态性，而不能进行多个基因的检测。经检索，利用DNA修复酶基因多态性检测的玻璃基因芯片，至今未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种同时检测XRCCIArg 194Trp、Arg399Gln 位点和XPDAsp312Asn基因多态性的玻璃基因芯片及其制备方法，并同时公开DNA修复酶基 因突变位点的特异性检测探针和阴性阳性对照探针，用于PCR扩增的上下游引物。该芯片 能够克服现有技术存在的不能一次检测多个基因多态性的缺陷，满足疾病预防控制和临床 医疗领域的需要。本专利技术所述人类DNA修复酶类基因多态性的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列 式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层，其中，所述的玻璃基片是经 醛基化处理的玻璃片，所述的寡核苷酸探针是6条不同位点的DNA修复酶基因特异性检测 探针，所述的对照是1条阳性对照探针和3条阴性对照探针，所述的空白是空白点样液对 照；其特征在于所述的6条不同位点的DNA修复酶基因特异性检测探针的基因序列分别是(XRCCl-194)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGGCCTAGTTG ；(XRCCl-194)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGAGGTAGTTG ；(XRCC1-399) _w:5，- (NH2) - (CH2) 6-Pol (dT) 15-ACGGGAGGGTCTCCATT ；(XRCCl-399)-m :5，-(NH2) -(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGCCTCCATT ；(XPD-312)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGTTGCTTCA ；(XPD-312)-m 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-CACGACGGGCTGCTTCA ；所述1条阳性对照探针的基因序列是β -actin :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA ；所述3条阴性对照探针的基因序列分别是(XRCC1-194)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGCGGTAGTTG ；(XRCC1-399)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGGCTCCATT ；(XPD-312)CK 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-CACGACGGGGTGCTTCA ；上述检测探针与对照探针均以poly (dT) 15作为连接臂，并在探针的5’端加入带氨基的六碳基团。上述每种探针与对照及空白分别以2X2方式在玻璃基片本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人类ＤＮＡ修复酶类基因多态性的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层，其中，所述的玻璃基片是经醛基化处理的玻璃片，所述的寡核苷酸探针是６条不同位点的ＤＮＡ修复酶基因特异性检测探针，所述的对照是１条阳性对照探针和３条阴性对照探针，所述的空白是空白点样液对照；其特征在于： 所述的６条不同位点的ＤＮＡ修复酶基因特异性检测探针的基因序列分别是： （ＸＲＣＣ１－１９４）－ｗ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＣＴＡＧＴＴＧ； （ＸＲＣＣ１－１９４）－ｍ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧ； （ＸＲＣＣ１－３９９）－ｗ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＣＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＴＴ； （ＸＲＣＣ１－３９９）－ｍ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＴＴ； （ＸＰＤ－３１２）－ｗ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＣＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＡ； （ＸＰＤ－３１２）－ｍ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡ； 所述１条阳性对照探针的基因序列是： β－ａｃｔｉｎ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＴＡＣＴＣＴＡＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡ； 所述３条阴性对照探针的基因序列分别是： （ＸＲＣＣ１－１９４）ＣＫ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＡＧＡＡＧＴＣＧＣＧＧＴＡＧＴＴＧ； （ＸＲＣＣ１－３９９）ＣＫ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＡＣＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＴ； （ＸＰＤ－３１２）ＣＫ：５’－（ＮＨ２）－（ＣＨ２）６－Ｐｏｌ（ｄＴ）１５－ＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡ； 上述每种探针与对照及空白分别以２×２方式在玻璃基片表面阵列排布４个平行的点涂层，每个点涂层的直径为０．１５ｍｍ，同种探针或对照或空白点涂层间距为０．４ｍｍ，不同探针或对照点涂层间距为０．８ｍｍ；芯片点涂层阵列总面积为３．５ｍｍ×６ｍｍ。...
【技术特征摘要】
一种检测人类DNA修复酶类基因多态性的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探针与对照及空白的点涂层，其中，所述的玻璃基片是经醛基化处理的玻璃片，所述的寡核苷酸探针是6条不同位点的DNA修复酶基因特异性检测探针，所述的对照是1条阳性对照探针和3条阴性对照探针，所述的空白是空白点样液对照；其特征在于所述的6条不同位点的DNA修复酶基因特异性检测探针的基因序列分别是(XRCC1-194)-w5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGGCCTAGTTG；(XRCC1-194)-m5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGAGGTAGTTG；(XRCC1-399)-w5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGTCTCCATT；(XRCC1-399)-m5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGCCTCCATT；(XPD-312)-w5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGTTGCTTCA；(XPD-312)-m5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGCTGCTTCA；所述1条阳性对照探针的基因序列是β-actin5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA；所述3条阴性对照探针的基因序列分别是(XRCC1-194)CK5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGCGGTAGTTG；(XRCC1-399)CK5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGGCTCCATT；(XPD-312)CK5’-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGGTGCTTCA；上述每种探针与对照及空白分别以2×2方式在玻璃基片表面阵列排布4个平行的点涂层，每个点涂层的直径为0.15mm，同种探针或对照或空白点涂层间距为0.4mm，不同探针或对照点涂层间距为0.8mm；芯片点涂层阵列总面积为3.5mm×6mm。2.权利要求1所述检测人类DNA修复酶类基因多态性的玻璃基因芯片的制备方法，步 骤是(1)玻片处理取未经化学修饰的常规玻璃片裸片以体积百分比浓度为5% 10%戊 二醛水溶液浸泡0. 5 1. 5小时，得到醛基化的玻璃片作为芯片的基片；(2)确定探针根据DNA修复酶基因XRCC1、XPD基因多态...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，宋宝，王哲海，白雪丽，刘曙光，张政伟，郑燕，吕丽燕，
申请(专利权)人：山东省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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