【技术实现步骤摘要】
本专利技术属灵芝菌株鉴别领域,特别是涉及一种树舌种菌株或子实体特异性分子标 记及其获得方法与应用。
技术介绍
在我国和日本民间树舌作为药物,主治急慢性肝炎、早期肝硬化、食管癌、肺癌、肝 癌、鼻咽癌、胰腺癌、胃癌、乳房癌。明显改善睡眠质量,曾强免疫力。对便秘,尿急, 尿频,美容,排肠毒等均有很好效果。还可以治疗风湿性肺结核,有止痛、清热、化积、 止血、化痰之功效。该菌子实体热水提取物对小白鼠肉瘤180的抑制率为64.9%。作为一种 药用真菌,它为人类治疗疾病发挥着重要作用。随着对灵芝的生物学功效的不断了解,以其为原料开发的产品越来越多,销售量也越 来越大,灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来,随着灵芝各种产品的商品化,大大带 动了中国灵芝栽培生产的迅速发展,同时灵芝的种质资源也在不断扩大,但是由于我国食 药用菌品种登记制度尚未完善,因此灵芝的生产用菌种比较混乱,同种异名和异名同种的 现象在栽培生产上非常普遍,这不仅给菌种的管理带来了难度,也给以灵芝为原料的保健 品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品 质量难以稳定的局面,也严重地制约了我国灵芝产品走出国门,走向国际市场的步伐。传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行,包括担孢子的大小和子实体真 皮菌丝的形态特征,但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化, 而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的,这给传统的分类学带来了很大的困难,仅仅 依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此,寻找可靠的鉴定手段,对灵芝产业的进 一步发展尤为重要。近年来,国内 ...
【技术保护点】
一种树舌种菌株或子实体的特异性分子标记,其特征在于:该标记是一种基因SCAR分子标记,是PCR扩增后为471bp的特异DNA片断,其PCR扩增引物对序列为5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttg tctctgtaac 3′。
【技术特征摘要】
1.一种树舌种菌株或子实体的特异性分子标记,其特征在于该标记是一种基因SCAR分子标记,是PCR扩增后为471bp的特异DNA片断,其PCR扩增引物对序列为5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttgtctctgtaac 3′。2. 树舌种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法,包括步骤I.菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取将4-6'C的菌种转接到PDA斜面上,26-28'C培养活化,5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培 养液中,26-28振荡培养10-14天,收集菌丝,用LETS法提取基因组DNA;(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎,用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时,过滤,水冲洗,研磨粉碎后,加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中,60-70。C保温1-3小时,10000-12000g离心2-5min后,取上清, 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA,其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 密纹薄芝种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、测序及序列比对 用ITS-PCR法,其中ITS引物对为ITS1F: 5,-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3,;ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',得密纹薄芝种及灵芝属其他种的菌株或 子实体ITS片段;然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。III. 特异性PCR引物的获得根据ITS序列的比对结果,找到密纹薄芝的ITS序列上特异性的结合位点,利用Primer Premier5.0 并设计出特异性 PCR 引物对为 5'cgtgaaacgggctcgtttat 3'禾口 5'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对密纹薄芝种菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩 增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。3. 根据权利要求2所述的密纹薄芝种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法,其特 征在于所述步骤I(1)中所述的LETS提取法① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉,后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液,分装于2个1.5ml的离心管中;② 向每个管中加入600-80(HiL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下颠倒,充分混匀,4-10°C 16000g离心8-15分钟;③ 轻轻吸取上清于新的离心管中,加入500|aL的PCI, 4°C 16000g离心8-15分钟;④ 重复步骤③,直到两相的界面没有杂质为止;⑤ 取上清,向上清液中加入2倍体积的已-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇,轻轻混匀, 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟;⑥ 取出,4。C16000g离心10-15分钟;⑦ 倒去上清,再向管中加入500pL预冷的70% V/V乙醇,用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解,静置一会儿,4。C16000g离心IO分钟;⑧ 重复步骤⑦1次;⑨ 倒去上清,待管中酒精挥发后,加入适量体积的TE缓冲液pH8.0,按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free R...
【专利技术属性】
技术研发人员:张劲松,唐传红,杨焱,苏春丽,贾薇,唐庆九,刘艳芳,郝瑞霞,周帅,冯娜,刘方,
申请(专利权)人:张劲松,唐传红,杨焱,苏春丽,贾薇,唐庆九,刘艳芳,郝瑞霞,周帅,冯娜,刘方,
类型:发明
国别省市:31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。