本发明专利技术公开了一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒，涉及一种基因诊断试剂盒。本发明专利技术包括：１）病原体浓缩液和ＤＮＡ、ＲＮＡ核酸同步提取液；２）含有四种病原体检测序列的阳性质粒，四种病原体包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体；３）一步法单管单酶多项联合检测的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ扩增体系。本发明专利技术同步实时检测；整个流程时间短，能效高；操作简单，封闭性检测，避免了可能的污染和人为误差；灵敏度高；适用于大规模高通量的血液筛查，如血液中心和生物制品生产企业开展核酸筛查，也可适用于大容量高效率的临床核酸检验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因诊断试剂盒，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、适合于常规血液安全核酸筛査的同步提取和同步实时检测肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、艾滋病毒以及梅毒螺旋体核酸的试剂盒。
技术介绍
艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎以及梅毒都是通过血液传播的重大传染性疾病，输血一直是上述疾病的主要传播途径之一。我国第一例临床报道的艾滋病病人就是通过输入不健康血液制品感染艾滋病毒的。世界卫生组织最新统计显示，全球每年有近百万人因输入不健康血液或血液制品感染艾滋病、病毒型肝炎等传染病；每年新增的艾滋病病毒携带者中，有5%至10%是经输血或血液制品感染。由于目前尚没有针对艾滋病和慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有效根治手段，梅毒虽然在感染早期能够通过抗生素治疗，但若诊断不及时也会造成神经梅毒等器质性病变，因而预防这几种重大传染性疾病的传播显得非常重要。卫生部和国家药品监督管理局要求单采浆站和生物制品企业必须依据《血液制品管理条例》、《单采血浆站基本标准》、《药品生产质量管理规范》和《中国生物制品规程》采集原料血浆和生产血液制品。原料血浆必须经两种不同的ELISA试剂初检、复检抗-HIV、抗-HCV、 HBsAg、梅毒和ALT合格后，方可用于生产。也就是说，为保障血液安全，必须进行艾滋、丙肝、乙肝病毒以及梅毒螺旋体四种病原的检测。因为艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎以及梅毒都是通过血液传播的重大传染性疾病，输血一直是上述疾病的主要传染途径之一。我国是临床用血大国，据国家卫生行政部门初步统计，2007年全国各主要血站采集的血液样本超过800多万份，为2百多万病人提供了输血治疗。另外我国每年血液制品(如人血白蛋白，静注丙种球蛋白等)生产所需的人血浆在3000吨，约需采集500多万4人份的人血浆，血源的质量安全至关重要。但到目前为止，国内仍主要通过酶联免疫法产品来进行血液的筛査。免疫学诊断法尽管随着第三代单克隆诊断抗体的出现，提高了检测的灵敏度，并在一定程度上减少了血源传播病毒性疾病的机率；但由于受免疫学诊断方法的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样(血浆)的漏检，其主要原因在于免疫学诊断主要依赖抗原/抗体的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可供检出的抗体滴度需要一段相对较长的时间；另外，由于个体免疫应答的不同,其中有少数感染者感染病毒后机体所产生的抗体滴度很低,很难用免疫学方法检测出来,甚至有些人无免疫应答反应，不产生抗体。因此，免疫学诊断方法不能检测出处于"窗口期"和新近感染病毒的献血员，势必造成漏检。因而无法确保用血的安全，每年各地都会发生相当数量因输血和使用血液制品而导致感染的病例，血液安全的快速确认检测是避免这几种重大传染性疾病的经血液传播的行之有效的手段，但由于目前使用血液安全检测技术有一定缺陷，存在较大的漏检隐患，必须研究新的先进的血液安全替代检测方法。国外研究证实，采用核酸检测方法(NAT)后，HBV、 HCV、 HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前9天、25天和14天。目前欧美血液制品生产企业已普遍采用NAT筛査血浆，冊0生物标准化委员会也有专门会议讨论并认定NAT在血液和血液制品病毒安全性检测方面的使用，迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种，即Roche C0BAS AmpliScreen HBV/HCV/ HIV和Chiron Procleix TMAHIV21/HCV检测系统，FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一为必须对50 cp/ ml的病毒核酸的检出率〉95 %。然而，尽管NAT方法在保障血液安全方面的优势显而易见，到目前为止，国内还没有推广和普及该项技术。并且，国外的情况并不完全适用于国内，国外的NAT方法针对的病源主要是HIV、 HBV、 HCV三种病毒，这三种病毒是影响国外血液安全的最大祸患；国内的情况是除了这三种病毒外，必须进行梅毒检测，因为随着改革开放和国内性观念的变化，梅毒的发病率呈上升趋势，也是影响血液安全的罪魁祸首。目前，尽管国外已研制和开发了针对三种病毒的NAT方法和试剂，也有企业正在报批相关产品，但国内外都还没有针对这四种病原体核酸同步定量检测的技术和产品。因此，开展血液安全高通量的多重(四重)PCR核酸检测方法(MNAT)对有效防止输血感染、保障血液安全有着十分重要和实际的意义。本发5明及其产品的推广应用将会极大地提供我国血液安全检测的技术水平，从传染源 头上减少和控制艾滋、肝炎等重大传染病的传播，必将产生无可估量的经济和社 会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种同步检测 肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒(简称本试剂盒)。 本专利技术的目的是这样实现的本试剂盒是一种多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括1) 病原体浓縮液和DNA、 RNA核酸同步提取液所述的病原体浓縮液是基于有机絮凝沉淀原理使用浓度为20%PEG6000的生 理盐水溶液对病原体进行浓缩；所述的DNA、 RNA同步提取液由终浓度为4 mol/L异硫氰酸胍，0. 5%十二垸 基肌氨酸钠，0.1腿ol/L 3巯基乙醇，25 mmol/L柠檬酸钠，0.20 g/L糖原组 成，其优点是既避免了漏检又不会干扰后续的荧光定量PCR检测，以此作为对 《以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法》专利技术(专利号ZL 01133528. 9)中血清中提取病原体核酸方法的补充。2) 含有四种病原体检测序列的阳性质粒四种病原体包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体。 阳性质粒含有这四种病原体PCR检测扩增片段的所有序列，其构建方法如下a) 利用T载体pTA-2构建分别含有四种病原体扩增片段的质粒(pT-HBV， pT-HCV， pT-HIV， pT-TP);b) 利用pTA-2(见附图l)多克隆位点两边最接近连接的扩增片段处都含有 EcoR I酶切位点，利用EcoR I酶单酶切回收得到分别含有四段酶切片段的小 片段；c) 将含有HIV、 HCV、 HBV和TP的小片段两两之间进行酶连(HIV与HCV， HBV与TP)，再分别以IR， 5， - GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3，(SEQ. ID.NO. 2)和CR:5， - CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC -3， ( SEQ. ID. NO. 5)， BF: 5， - GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C —3， ( SEQ. ID. NO. 7)和TR: 5，-TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG_3， ( SEQ.ID.NO.il)为上下游引物，用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，扩增产物带有A尾)分别 对HIV&HCV,朋V&TP小片段的酶连产物进行特异性PCR扩增(分别用引物IR&CR 和BF&TR)放大并分别进行回收；d) 将回收的片段分别与pTA-2载体进行连接，测序并将形成的质粒分别转 化到大肠杆菌Top IO细胞中；e) 利用pTA-2载体多克隆位点仅仅含有一个Pst I酶酶切位点且紧挨其中一 个EcoR I酶切位点，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒，其特征在于： １）病原体浓缩液和ＤＮＡ、ＲＮＡ核酸同步提取液； ２）含有四种病原体检测序列的阳性质粒，四种病原体包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体； ３）一步法单管单酶多项联合检测的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ扩增体系，由含有２０．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ↓［４］的１０ｘｂｕｆｆｅｒ，１０μｍｏｌ／Ｌ的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体上下游引物，１０μｍｏｌ／Ｌ的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒以及梅毒螺旋体的荧光探针，２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ↓［２］，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ｍｉｘ和无菌双蒸水组成，其中引物和标记探针如下： ①乙型肝炎病毒 正向引物为５′－ＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴＣ ＴＴＣＣＴＣ－３′， 反向引物为５′－ＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣ－３′； 荧光探针序列为５′－ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧ－３′； 荧光探针５′端标记报告荧光基团ＴＡＭＲＡ，３ ′端标记不发光的淬灭基团Ｅｃｌｉｐｓｅ标记，标准阳性模板ｐＴ－ＨＢＶ是含有乙型肝炎病毒的Ｐｒｅ－Ｓ基因的９８个碱基对的核苷酸片段构成的ｐＴＡ－２载体，该载体在大肠杆菌Ｔｏｐ１０中增殖； ②丙型肝炎病毒 正向引物为５′－ＴＣＡＧＣ ＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧ－３′， 反向引物为５′－ＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣ－３′； 荧光探针序列为５′－ＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴ－３′； 荧光探针５′端标记报告荧光基团 ＦＡＭ，３′端标记不发光的淬灭基团Ｅｃｌｉｐｓｅ标记，标准阳性模板ｐＴ－ＨＣＶ是含有丙型肝炎病毒的５’ＵＴＲ序列的９８个碱基对的核苷酸片段构成的ｐＴＡ－２载体，该载体在大肠杆菌Ｔｏｐ１０中增殖； ③艾滋病毒 正向引物为５′－ＣＡ ＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧ－３′， 反向引物为５′－ＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣ－３′； 荧光探针序列为５′－ＡＧＣＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧ－３′； 荧光探针５′ 端标记报告荧光基团ＪＯＥ／ＶＩＣ／Ｃｙ－３，３′端标记不发光的淬灭基团Ｅｃｌｉｐｓｅ标记，标准阳性模板ｐＴ－ＨＩＶ是含有艾滋病...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，周立，唐景峰，龚路路，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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