人源化中和性抗流感ＮＳ１基因工程抗体制备方法与用途技术

本发明专利技术涉及一种人源化抗流感病毒ＮＳ１蛋白中和性抗体的制备方法与用途。通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒ＮＳ１抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床抗甲型病毒药物评价和甲型病毒治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人源化单克隆抗体的制备方法与用途，具体涉及一种人源化抗流感病毒NS1蛋白中和性抗体的制备方法与用途。
技术介绍
甲型流感是甲型流感病毒引起的一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。它的传染性极强，极易造成世界范围内的大流行。历史上流感的大流行曾经夺去许多人的生命，据世界卫生组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为6亿 12亿例，死亡50万 100万人，其中重症流感病例300万 500万例，重症流感的病死率为8% 10%。 2009年在墨西哥暴发并迅速在全球蔓延的人感染甲型(H1N1)流感疫情目前已造成近IO万人感染，上千人死亡，引发全球恐慌。目前仍无特效的治疗流感的方法。又由于其抗原变异性强，宿主范围广，各亚型间几乎没有交叉保护性，使得流感难以控制和频繁爆发。而作为一类新型特异性抗病毒感染的生物工程制剂 一 中和性抗体，在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。因此，研制一种针对流感病毒的广谱中和效应的抗体用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的。 甲型H1N1病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus A)，其遗传物质为RNA。甲型H1N1流感病毒携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm 120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm。猪流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13. 6kb，由大小不等的8个独立片段组成。共编码10个多肽，其中节段1编码PB2蛋白，节段2编码PB1蛋白，节段3编码PA蛋白，节段4编码血凝素(HA)，节段5编码核蛋白(NP)，节段6编码神经氨酸酶(NA)，节段7编码基质蛋白1和2(Ml/2)，节段8编码非结构蛋白1和2(NS1/2)。在8个基因片段中最短的是NS1基因。由于HA和NA分子容易发生抗原漂移或突变(每年每核苷突变率为10—，其抗原性表现出很大的变异，而且A型流感病毒亚型众多，各亚型诱导的抗体不能相互交叉保护。 而NS1蛋白是流感病毒NS1基因编码的一种小分子、非结构的RNA结合蛋白，可以编码202-237氨基酸，能与特定RNA序列结合，然后对基因表达的转录后行为进行调节，是一个具有多种活性的调控因子。NS1蛋白只在病毒感染的细胞中合成，并未被包装进病毒颗粒。在病毒感染早期即有大量NS1蛋白表达，其在细胞浆合成后很快转移至核内，并积聚在病毒感染早期的胞核内，在感染后期则聚积于核仁中，形成致密的晶体样包涵体，提示NS1蛋白在病毒复制及早期抵抗机体的抗病毒免疫过程中具有重要作用。反向遗传系统实验证实了 NS1蛋白在保护流感病毒抵抗细胞IFN反应中的重要作用，当缺乏NS1基因时，重组病毒A/PR/8/34(HlNl)仅能在细胞IFN反应缺陷时复制。研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记。 绝大多数甲型流感病毒NS1蛋白具有两个比较重要的功能区A区和B区。A区为氨基端的RNA结合区，NS1蛋白可通过此区与不同种类的RNA包括dsRNA相结合；B区为分子羧基端的效应区，此区可与宿主细胞核蛋白相互作用，抑制宿主细胞核mRNA的运输。通过这两种途径，NS1蛋白可拮抗IFN-a /|3 ，抑制细胞mRNA前体加工和mRNA转运，促进病毒mRNA翻译，增强病毒复制等。因此，拮抗NS1蛋白的功能对于抑制甲型流感病毒复制和限制病毒传播至关重要。 随着抗体库技术的出现，抗体工程进入崭新的发展阶段。通过基因重组技术将抗体分子在基因水平上重组、表达、纯化，可获得多种多样的特异性的人源化抗体，为将来可能的临床诊断、预防和治疗提供可行性的。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒NS1抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床抗甲型病毒药物评价和甲型病毒治疗。 本专利技术是这样实现的NS1蛋白只在病毒感染的细胞中合成，并未被包装进病毒颗粒。在病毒感染早期即有大量NS1蛋白表达，其在细胞浆合成后很快转移至核内，并积聚在病毒感染早期的胞核内，在感染后期则聚积于核仁中，形成致密的晶体样包涵体，提示NS1蛋白在病毒复制及早期抵抗机体的抗病毒免疫过程中具有重要作用。反向遗传系统实验证实了 NS1蛋白在保护流感病毒抵抗细胞IFN反应中的重要作用，当缺乏NS1基因时，重组病毒A/PR/8/34(HlNl)仅能在细胞IFN反应缺陷时复制。本专利技术采用NS1蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记这一特性，通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒NS1抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床抗甲型病毒药物评价和甲型病毒治疗。 本专利技术的积极效果 —、提供一种新型的流感病毒及其药物评价检测方法。 二、提供一种可针对幼儿和老人等不适宜接种流感疫苗的人群进行流感病毒感染后的治疗。具体实施方案 以下的优先实施例对本专利技术做详细说明，但不意味着限制本专利技术的内容。 利用基因工程技术克隆人甲型流感病毒H1N1亚型NS1基因，在原核表达系统表达NS1蛋白，通过提取、纯化获得纯度较高的NS1蛋白。用NS1蛋白做抗原对噬菌体抗体库进行富集筛选，并在E. coli中进行分泌表达。通过ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定抗体对人甲型H1N1流感病毒特异性结合的功能活性，并进行序列测定。然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体Pac-L-Fc，转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA、 IFA、 Western Blot和流式细胞仪对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。 实施例1 :抗原制备 利用基因工程技术将流感病毒NS1基因重组至表达载体pTXB l转化感受态E. coliBL21 (DE3)，挑取LB (Amp+)琼脂平板上的单菌落，接种于5ml LB (Amp+)培养基，37 °C振荡培养过夜，次日按l : 100的比例转种，扩大培养至A600 二0. 5 0. 7时，加入终浓度为1. 0mmol/LIPTG，37。C表达6小时用50ml Columnbuffer平衡几丁质亲和柱，取超声破菌的上清液上样，用80ml Column buffer去除杂蛋白，再用用30ml 30mmol/L DTT[使用前切割缓冲液(20mmol/LTris-HCl 500mmol/L NaCl，O. lmmol/L EDTA pH 8.0)稀释]慢速冲洗柱子，关闭出样口，4t:切割过夜。次日用不含DTT的30ml切割缓冲液冲洗，收集目的蛋白峰，将所获得的目的蛋白溶液置于透析袋内，在磁力搅拌器的作用下，以蒸馏水为透析液透析48h，用蔗糖覆盖透析袋以浓縮蛋白采用Bradford法对纯化的重组蛋白进行定量，并检测相对分子质量。 实施例2 :噬菌体抗体库的生物筛选 以100g/ml的NS1抗原溶液150 ii 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源化中和性抗流感ＮＳ１基因工程抗体制备方法与用途，其特征为：通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒ＮＳ１抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床抗甲型病毒药物评价和甲型病毒治疗。

【技术特征摘要】
人源化中和性抗流感NS1基因工程抗体制备方法与用途，其特征为通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与甲型流感病毒NS1抗原特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽萍，袁福宁，
申请(专利权)人：河南中医学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]