一种改进的卷烟烟气体外染毒方法技术

一种改进的卷烟烟气体外染毒方法，采用卷烟烟气气相部分（ＧＶＰ）与粒相部分（ＴＰＭ）混合后进行体外染毒试验，来评价卷烟烟气的生物学效应，具体方法如下：ａ、烟气粒相部分与气相部分收集，ｂ、粒相部分与气相部分混合，ｃ、体外染毒：将１∶１的配比的ＴＰＭ＋ＧＶＰ稀释到不同浓度梯度，通过体外染毒的方法来进行细胞毒性试验、微核试验及Ａｍｅｓ试验。本发明专利技术的特点在于：通过吸收瓶来收集卷烟烟气气相部分，采用ＧＶＰ结合ＴＰＭ进行体外染毒的方式，可以全面真实的反映卷烟烟气的生物学效应，在以往ＴＰＭ染毒方式的基础上，增加了卷烟烟气气相部分的染毒，使体外染毒方法更接近于实际的卷烟烟气暴露情况。且染毒浓度易控，操作简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种巻烟烟气的体外染毒方法，即采用巻烟烟气气相部分(GVP)和粒相部分(TPM)相结合的方式进行体外染毒，使受试对象(细胞或细菌)的染毒环境更接近于实际的巻烟烟气暴露情况。
技术介绍
在巻烟添加剂的毒理学评价方面，国外的一些研究机构和公司已经开展了大量的研究工作。Clements等人进行了巻烟添加剂体外毒理学评价的研究，研究侧重于巻烟添加剂体外毒理学评价的研究设计，根据遗传毒理测试的标准方法，细菌突变-Ames test,哺乳类细胞突变-小鼠淋巴瘤分析和培养的人类细胞或中国仓鼠细胞染色体结构变异分析，体外微核分析-利用复制指数作为毒性指标，细胞毒性分析-Neutral Red test,并针对烟气粒相部分的特点进行了特殊的试验设计。英美烟草公司Massey等人研究了烟草添加剂对烟气化学及毒性的影响，对于烟草添加剂，采用以下4种试验l)直接高温热解，分析产物；2)添加入香烟，观察对烟气化学的影响-霍夫曼名单列出的有害成分；3)体外生物活性测定；4)吸入毒性测定。PHILIP MORRIS公司对巻烟添加剂评价的一般原则是关于烟气的化学分析，基于两大团体即美国消费者保护委员会(霍夫曼名单)和国际癌症研究协会(IARC)的推荐，分析约50种烟气组分。使用三种测试烟气遗传毒性的试验(Ames试验、小鼠淋巴肉瘤细胞株致突变试验、.大鼠红细胞微核试验)，比较了无添加成分的对照巻烟和添加了不同量成分的受试巻烟的毒理学效应。国内一些科研单位开展了一些烟草烟气体外毒性测试的研究和烟草烟气的动物体内试验。但是，这些研究多是基于巻烟烟气粒相部分(TPM)染毒方式进行的，只能反映出TPM的生物学效应。而巻烟烟气不仅含有巻烟烟气粒相部分，同时还含3有大量的有害气相组分，仅采用TPM染毒方式是不能全面真实地评价巻烟烟气的生物学效应。与本专利技术相近的专利技术专利为CN101393190《巻烟主流烟气细胞毒性测定方法》，将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的巻烟主流烟气中进行暴露，然后通过中性红染色，根据细胞摄入中性红的情况，利用可读多孔培养板分光光度计进行吸光度值测定，与洁净空气暴露对照样品比较，进而判断巻烟主流烟气毒性。其特征是将细胞直接暴露于巻烟主流烟气，虽然是巻烟烟气直接暴露，但是接触细胞的巻烟烟气气相部分仍然是溶于水的一部分气相物质，并且与细胞接触的巻烟烟气浓度不容易控制。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对以上不足而进行了改进。通过一定途径来收集巻烟烟气气相部分(GVP)，采用GVP结合TPM进行体外染毒的方法，可以全面真实的反映巻烟烟气的生物学效应。本专利技术在以往TPM染毒方式的基础上，增加了巻烟烟气气相部分的染毒,使体外染毒方法更接近于实际的巻烟烟气暴露情况。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术改进的巻烟烟气体外染毒方法，采用巻烟烟气气相部分(GVP)与巻烟烟气粒相部分(TPM)混合后进行体外染毒试验，来评价巻烟烟气的生物学效应，具体方法如下a、 烟气粒相部分与气相部分收集通过吸烟机与剑桥滤片及气体吸收瓶相串连的方式分别收集烟气粒相部分和烟气气相部分，吸收瓶内加入磷酸盐缓冲液，并将吸收瓶置于含冰块的杜瓦瓶内，保证缓冲液在整个收集过程中低于4°C;b、 粒相部分与气相部分混合将剑桥片收集的TPM采用DMS0进行萃取，萃取浓度为10mg/ml，向吸收瓶中加入与萃取TPM所用DMS0体积相同的磷酸盐缓冲液，然后将TPM与GVP按1 : 1配比；c、 体外染毒将l: 1的配比的TPM+GVP稀释到不同浓度梯度，通过体外染毒的方法来进行细胞毒性试验、微核试验及Ames试验。本专利技术的特点在于通过吸收瓶来收集巻烟烟气气相部分，采用GVP结合TPM进行体外染毒的方式，可以全面真实的反映巻烟烟气的生物学效应，在以往TPM染毒方式的基础上，增加了巻烟烟气气相部分的染毒，使体外染毒方法更接近于实际的巻烟烟气暴露情况。另外而本专利技术中将粒相与气相分别收集，染毒浓度易控，并且收集方法容易操作。附图说明图1为本专利技术的具体流程示意图。图2为本专利技术收集烟气粒相部分和气相部分的设备仪器连接示意图。图2中l为Borgwaldt (T游潜^:錄J转盘吸烟机；2为收集TPM的剑桥滤片，3为GVP吸收瓶，4为杜瓦瓶冰浴，5为空气泵，6为烟气管路。具体实施例方式本专利技术以下结合实例做进一步描述实例l对参比巻烟2R4F进行体外染毒。按照本专利技术所述方法，连接吸收瓶与吸烟机，抽吸20支巻烟之后，用DMS0将TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入与DMSO等体积无转镁磷酸盐缓冲液，使浓度为等量的10mg/mL，将TPM与GVP1:l配比。选用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，分别用TPM、 GVP、 TPM+GVP来迸行细胞毒性试验，染毒后，结果如下<table>table see original document page 5</column></row><table>注* EC50是50% effective eoncentration半数有效浓度结果显示，GVP确实有生物学效应，并且TPM+GVP的生物学作用强于TPM和GVP单独的作用。实例2对某一国产烤烟型品牌巻烟进行体外染毒。按照本专利技术所述方法，按照所述方法，连接吸收瓶与吸烟机，抽吸20支巻烟之后，用DMSO将TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入与DMSO等体积无钙镁磷酸盐缓冲液，使浓度为等量的10mg/mL，将TPM与GVP1: 1配比。将TPM+GVP浓度配制为25、 50、 100、125、 250、 500ug/mL。阳性对照为无活化系统时TA98阳性对照为40 n g/mL硝基笏，TA100阳性对照为10g/mL;有活化系统时TA98、 TA100阳性对照为20ug/mL蒽胺。阴性对照为溶剂对照。然后，吸取配制好的0. lmL受试物与0. lmL菌液混匀，在37'C条件下，预培养30min;需活化的另加入0.5mL59&S9混合液。之后，取已融化并在45。C水浴中保温的顶层培养基一管(2mL)，加入0. 2mL受试物菌液混合液，活化的加入0.7mL受试物、菌液及S9混合液，迅速混匀，倒入底层平板培养基上，转动平板使顶层培养基均匀分布在底层上，平方固化，37。C培养48h;计数各平板回突变菌落数。6<table>table see original document page 7</column></row><table>结果显示，TPM+GVP致突变能力强于TPM。实例3选用参比巻烟2R4F，进行体外染毒。按照本专利技术所述方法，连接吸收瓶与吸烟机，抽吸20支巻烟之后，用DMSO将TPM萃取到10mg/mL，然后往吸收瓶加入与DMSO等体积无钙镁磷酸盐缓冲液，使浓度为等量的10mg/mL,将TPM与GVP1: l配比。然后进行体外微核试验，培养CH0至浓度达到lX105个细胞/niL，将细胞悬液按5mL/瓶接种于50mL的培养瓶。过夜培养使细胞贴壁。用细胞培养基将萃取液稀释，TPM和TPM+GVP溶液配制为不同剂量50 ug/mL、 75ng/mL、 100 u g/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的卷烟烟气体外染毒方法，其特征在于：采用卷烟烟气气相部分（ＧＶＰ）与卷烟烟气粒相部分（ＴＰＭ）混合后进行体外染毒试验，来评价卷烟烟气的生物学效应，具体方法如下：　　ａ、烟气粒相部分与气相部分收集：通过吸烟机与剑桥滤片及气体吸收瓶相串连的方式分别收集烟气粒相部分和烟气气相部分，吸收瓶内加入磷酸盐缓冲液，并将吸收瓶置于含冰块的杜瓦瓶内，保证缓冲液在整个收集过程中低于４℃；　　ｂ、粒相部分与气相部分混合：将剑桥片收集的ＴＰＭ采用ＤＭＳＯ进行萃取，萃取浓度为１０ｍｇ／ｍｌ，向吸收瓶中加入与萃取ＴＰＭ所用ＤＭＳＯ体积相同的磷酸盐缓冲液，然后将ＴＰＭ与ＧＶＰ按１∶１配比；　　ｃ、体外染毒：将１∶１的配比的ＴＰＭ＋ＧＶＰ稀释到不同浓度梯度，通过体外染毒的方法来进行细胞毒性试验、微核试验及Ａｍｅｓ试验。

【技术特征摘要】
1、一种改进的卷烟烟气体外染毒方法，其特征在于采用卷烟烟气气相部分(GVP)与卷烟烟气粒相部分(TPM)混合后进行体外染毒试验，来评价卷烟烟气的生物学效应，具体方法如下a、烟气粒相部分与气相部分收集通过吸烟机与剑桥滤片及气体吸收瓶相串连的方式分别收集烟气粒相部分和烟气气相部分，吸收瓶内加入磷酸盐缓冲液，并将吸收瓶置于含冰块的杜瓦瓶内，保证缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚平平，李翔，聂聪，赵乐，彭斌，刘惠民，谢剑平，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]