【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高纤维素酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物基因工程。
技术介绍
1、纤维素是烟叶结构的主要成分，与半纤维素和木质素共同构成烟草细胞壁，决定了烟叶的完整性，同时其含量也与烟叶品质相关。在烟叶燃烧过程中，纤维素可以增强烟叶的持火力；但是当烟叶中纤维素含量过多时，会使烟叶组织变的粗糙且易破碎，影响加工可塑性，也会导致烟叶燃烧时刺激性增大，杂气变重，香气被掩盖。而且纤维素在不完全燃烧时会产生有害物质，例如大量纤维素在超过600℃时会裂解产生稠环芳烃。因此，探索安全有效的技术降解烟叶中的纤维素，使其转化成水溶性的还原糖等小分子物质，进而提高烟叶的质量及安全性，已成为大家普遍关注的问题。
2、微生物或酶制剂发酵技术能够有效降低烟叶中纤维素的含量，促进烟草薄片、烟叶以及烟梗内部的有机物大分子的分解以及转化，减少亚硝酸、苯并芘等有害物质的产生。国内外学者对醇化烟叶中起主要作用的微生物以及纤维素酶进行了广泛研究，但是目前获得的纤维素菌株大都存在产酶能力低、稳定性以及分解能力相对较差等问题。
3、申请公布号为cn103184163a的中国专利技术专利公开了异源表达内切葡聚糖酶基因的木霉工程菌及其应用，具体公开了一种携带有能表达特异腐质酶内切葡聚糖酶表达载体的木霉。该木霉工程菌能高效表达特异腐质酶内切葡聚糖酶基因，从而增加了其纤维素酶的内切酶组分，改变了酶学ph特性，明显扩大了其纤维素酶系在中性和碱性条件下的适用范围。但是由纤维素酶活性检测结果分析，相较于原始木霉，表达内切葡聚糖酶基因的木霉工
4、申请公布号为cn103865949a的中国专利技术专利公开了一种基因敲除选育纤维素酶高产菌株的方法，具体公开了利用基因敲除技术，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲除淀粉酶基因后，细胞负荷减少，得到的纤维素酶菌株的纤维素酶活性为21u/g。相比于原始黑曲霉，该基因敲除的黑曲霉的纤维素酶活性有提高，但还存在产酶能力较低的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的在于提供一种提高纤维素酶活性的基因工程菌，以解决现有技术中产纤维素酶的基因工程菌的纤维素酶活性较低的问题。
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，以解决现有技术中的构建方法构建的产纤维素酶的基因工程菌的纤维素酶活性较低的问题。
3、本专利技术的第三个目的在于提供基因工程菌在纤维素酶生产中的应用，以解决现有技术中产纤维素酶的基因工程菌的纤维素酶活性较低的问题。
4、本专利技术的第四个目的在于提供基因工程菌在醇化烟叶纤维素降解中的应用，以解决现有技术中用于醇化烟叶纤维素降解的菌株纤维素酶活性较低的问题。
5、为了实现上述目的，本专利技术中一种提高纤维素酶活性的基因工程菌的技术方案是：
6、一种提高纤维素酶活性的基因工程菌，所述工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌，过表达内切葡聚糖酶c36基因；所述c36基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过筛选分析发现，在枯草芽孢杆菌中过表达内切葡聚糖酶c36基因能有效提高枯草芽孢杆菌的纤维素酶活性，成功构建了高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。经检测，以cmc-na为底物时，测得的纤维素酶工程菌株的cmc酶活为52.88u/ml，fpa酶活为30.81u/ml。相比于阴性对照菌株pmb-bs(转化空载体的枯草芽孢杆菌)，cmc酶活增加了4.6倍，fpa酶活增加了1.6倍。本专利技术提供的基因工程菌显著提高了纤维素酶产量和酶活，适合在工业中大规模生产使用。同时枯草芽孢杆菌是公认的安全菌株，与其他表达系统相比，具有无毒、发酵周期短、分泌能力强、易于培养等优势。
8、为了实现上述目的，本专利技术中一种提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法的技术方案是：
9、一种提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，构建表达内切葡聚糖酶c36基因的重组表达载体，转化入枯草芽孢杆菌中，使内切葡聚糖酶c36基因过表达。
10、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术构建方法构建的基因工程菌纤维素酶活性相较于初始菌株和阴性对照菌株pmb-bs明显提高，而且本专利技术的方法操作简单，成功率高，适合工业化生产。
11、作为进一步地改进，所述重组表达载体的构建为：将获得的内切葡聚糖酶c36基因与线性化的出发载体通过同源重组进行连接，获得重组表达载体。
12、上述技术方案的有益效果在于：相较于传统的酶切连接方法能够简单、快速且高效的获得重组载体，降低载体自连背景，显著提高克隆重组效率。
13、作为进一步地改进，所述出发载体为pmb402-1。
14、为了实现上述目的，本专利技术一种提高纤维素酶活性的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用的技术方案是：
15、一种提高纤维素酶活性的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用。
16、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术提供了一种提高纤维素酶活性的基因工程菌，在cmc-na和滤纸为酶活测定底物的条件下，所产生的纤维素酶cmc酶活为52.88u/ml、fpa酶活为30.81u/ml，相比于现有技术，本专利技术提供的基因工程菌的纤维素酶活性显著增加。而且本专利技术在40～90℃温度范围内检测基因工程菌的纤维素酶活性，结果证明在40～90℃温度范围内基因工程菌的纤维素酶活性均保持在较高的水平范围，无明显改变，能满足不同温度条件下的应用。
17、作为进一步地改进，将基因工程菌的种子液接种于cmc-na液体产酶培养基中发酵培养。
18、作为进一步地改进，所述种子液的制备为：将保存的基因工程菌接种于活化培养基中培养。
19、上述技术方案的有益效果在于：将保存的原始基因工程菌先进行活化培养，有助于后续大量发酵培养时菌株的活性和生长状态。
20、作为进一步地改进，以1000份水计，所述活化培养基包括：胰蛋白胨17份，氯化钠5份，大豆木瓜蛋白酶水解物3份，磷酸二氢钾2.5份，葡萄糖2.5份。
21、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过实验证明，选择上述配方的活化培养基进行原始基因工程菌的活化制备种子液，种子液接种产酶培养基后，纤维素酶的活性有大幅度的提高。
22、为了实现上述目的，本专利技术中一种提高纤维素酶活性的基因工程菌在醇化烟叶纤维素降解中的应用的技术方案是：
23、一种提高纤维素酶活性的基因工程菌在醇化烟叶纤维素降解中的应用。
24、上述技术方案的有益效果在于：本专利技术通过实验证明，相比于阴性对照菌株pmb-bs，本专利技术构建的基因工程菌以醇化烟叶为底物的条件下，cmc酶活从14.10u/ml增加至30.41u/ml，fpa酶活从13.83u/ml增加至21.71u/ml，能有效降解醇化烟叶中的纤维素，这为醇化烟叶纤维素降解提供了新的、安本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高纤维素酶活性的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌，过表达内切葡聚糖酶C36基因；所述C36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：构建表达内切葡聚糖酶C36基因的重组表达载体，转化入枯草芽孢杆菌中，使内切葡聚糖酶C36基因过表达。
3.根据权利要求2所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述重组表达载体的构建为：将获得的内切葡聚糖酶C36基因与线性化的出发载体通过同源重组进行连接，获得重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述出发载体为pMB402-1。
5.一种如权利要求1所述的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：将基因工程菌的种子液接种于CMC-Na液体产酶培养基中发酵培养。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的基因工程菌在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：以1000份水计，所述活化培养基包括：胰蛋白胨17份，氯化钠5份，大豆木瓜蛋白酶水解物3份，磷酸二氢钾2.5份，葡萄糖2.5份。
9.一种如权利要求1所述的基因工程菌在醇化烟叶纤维素降解中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高纤维素酶活性的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌，过表达内切葡聚糖酶c36基因；所述c36基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：构建表达内切葡聚糖酶c36基因的重组表达载体，转化入枯草芽孢杆菌中，使内切葡聚糖酶c36基因过表达。
3.根据权利要求2所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述重组表达载体的构建为：将获得的内切葡聚糖酶c36基因与线性化的出发载体通过同源重组进行连接，获得重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的提高纤维素酶活性的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述出发载体为pm...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶界锰，孔蒙蒙，卢鹏，陈千思，金静静，曹培健，郑雪坳，王晨，许亚龙，顾梦丽，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：
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