【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于塑料降解，尤其涉及一种高效降解塑料(pe)的交联酶制剂及其制备方法与应用。
技术介绍
1、塑料是一种高分子化合物，化学惰性强，难以降解，常见类型有聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)以及丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚合物(abs)，72％的塑料最终进入自然环境易造成“白色污染”。聚乙烯占世界塑料总产量的30％，同时全球对聚乙烯塑料的需求量在以每年12％的速度增长，但能够回收再利用的塑料制品占比极低。长时间填埋会使塑料变成危害性极大的微塑料，污染地下水及土壤。焚烧则会产生有毒有害气体，如co、so2、h2s、二噁英等，易造成二次污染。生物降解反应条件温和、产物无污染，对聚乙烯降解具有重大意义。近年来，为缓解“白色污染”，可降解塑料被广泛推广使用，但环境中残留的pe塑料体量大、降解周期长、降解率低等系列问题亟待解决。
2、研究发现pe生物降解三种关键酶分别为漆酶、锰过氧化物酶、脂肪酶，同时聚合物的生物降解不仅可以由纯菌株完成，菌落联合体的降解效率更高。而游离的聚乙烯降解酶稳定性差，易受温度、ph、离子浓度等因素影响而失活，且难以回收、重复利用。相较于游离酶，固定化酶稳定性高，易于回收利用，可有效降低生产成本。
3、酶的固定化技术既能高效保持酶的催化特点，又能克服游离酶性质不稳定、难以回收利用等缺点，在各个领域均有重要的应用。固定化酶的性能取决于载体选择、固定化方法等。改进后的hummers法制得的go表面含氧官能团含量更高，更易剥离。cleas技术相较于传统固定化技术
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于提供一种高效降解塑料(pe)的交联酶制剂。
2、本专利技术的再一目的在于提供上述高效降解塑料(pe)的交联酶制剂的制备方法。
3、本专利技术的另一目的在于提供上述交联酶制剂的应用。
4、本专利技术是这样实现的，一种高效降解塑料的交联酶制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
5、(1)取氯化铁和硫酸亚铁加入超纯水中，在75～85℃水浴、剧烈搅拌下加入氨-硝酸铵缓冲液，得到铁盐溶液；
6、(2)将氧化石墨烯go水溶液加入到所述铁盐溶液中，在75～85℃下超声45min，磁力搅拌反应6h，将反应产物离心所得沉淀经洗涤、烘干，得到go/fe3o4磁性纳米材料；
7、(3)将go/fe3o4磁性纳米材料在蒸馏水中分散，加入edc和nhs，搅拌1～3h，用磁铁收集活化的go/fe3o4，用蒸馏水洗涤；
8、(4)将活化的go/fe3o4在超声均质处理后加入到复合酶溶液中，在28～32℃水浴摇床孵育11～13h，磁分离收集固体产物并用pbs缓冲液洗涤，冻干过夜，得到粉状的交联酶制剂；其中，所述复合酶溶液为含有pe降解酶的pbs缓冲液，所述pe降解酶由漆酶、锰过氧化物酶、脂肪酶构成。
9、优选地，在步骤(1)中，所述氨-硝酸铵缓冲液为将氨水和硝酸铵按摩尔比为2﹕1混合后，用质量浓度为25％的浓氨水滴加至ph为10得到；
10、所述氯化铁、硫酸亚铁、超纯水、氨-硝酸铵缓冲液的质量体积比为2.5～3g﹕1.5～2.5g﹕100ml﹕50ml。
11、优选地，在步骤(2)中，所述氧化石墨烯go水溶液中，氧化石墨烯go与水的质量体积比为0.4～0.6g:200ml；
12、所述氧化石墨烯go水溶液与铁盐溶液的体积比为100ml:100～200ml；
13、所述洗涤、烘干具体为：将所得沉淀用无水乙醇、超纯水先后各洗涤3次后，在真空烘箱中烘干。
14、优选地，在步骤(3)中，所述go/fe3o4磁性纳米材料、蒸馏水、edc、nhs的质量体积比为100mg﹕100ml﹕100～120mg﹕80～100mg。
15、优选地，在步骤(4)中，超声均质处理具体为：将活化的go/fe3o4在频率为40khz、功率为400w条件下超声均质处理30min；
16、所述复合酶溶液中，漆酶、锰过氧化物酶、脂肪酶的质量比为0.9～1.1：0.9～1.1：0.9～1.1。
17、优选地，在步骤(4)中，所述pe降解酶与活化的go/fe3o4的质量比为1﹕99、2﹕98、3﹕97、4﹕96或5﹕95。
18、优选地，在步骤(3)中，所述复合酶溶液的制备包括以下步骤：
19、(a)将枯草芽孢杆菌c2a和c31按浓度比1﹕2混合，按体积分数为4％的接种量接种至发酵培养基中，得到复配接种菌液；
20、(b)将所述接种菌液接种到发酵罐中，在32℃下恒温震荡培养，得到发酵液；
21、(c)分别用不同金属离子、在不同水平浓度下处理所述发酵液，提升三种pe降解酶的活性和产量；
22、(d)将活性和产量提升后的所述发酵液经真空冷冻浓缩、硫酸铵分级沉淀，分别提取并收集得到漆酶、锰过氧化物酶、脂肪酶，将所得漆酶、锰过氧化物酶、脂肪酶按质量比0.9～1.1：0.9～1.1：0.9～1.1溶于pbs溶液，得到复合酶溶液。
23、优选地，在步骤(a)中，所述发酵培养基为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾0.7g，磷酸氢二钾0.7g,七水硫酸镁0.7g，硝酸钠2.0g，氯化钠0.005g，七水硫酸亚铁0.002g，七水硫酸锌0.002g，硫酸锰0.001g，去离子水1000ml，ph自然，121℃灭菌15min；
24、在步骤(c)中，所述处理具体为：采用1mmol/l mn2+作用6d诱导漆酶、8mmol/l fe3+作用4d诱导锰过氧化物酶、8mmol/l ca2+作用2d诱导脂肪酶，提升酶的活性和产量；
25、在步骤(d)中，所述硫酸铵分级沉淀具体为：收集复配菌发酵液，10,000r/min离心10min，上清液中加入不同饱和度硫酸铵，冰水浴中温和搅拌，4℃过夜后离心得到蛋白沉淀，溶于等量pbs中，备用；其中，漆酶、锰过氧化物酶及脂肪酶提取参数分别为：饱和度45％，10,000r/min离心30min；饱和度85％，12,000r/min离心20min；饱和度80％，6,000r/min离心30min。
26、本专利技术进一步公开了上述方法制备得到的交联酶制剂。
27、本专利技术进一步公开了上述交联酶制剂在降解塑料中的应用。
28、相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：
29、(1)本专利技术以go/fe3o4磁性纳米材料为载体并固定化pe降解关键酶，制备的pe降解交联酶制剂中pe降解关键酶固载率可达100％，在塑料降解模拟实验中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效降解塑料的交联酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述氨-硝酸铵缓冲液为将氨水和硝酸铵按摩尔比为2﹕1混合后，用质量浓度为25％的浓氨水滴加至pH为10得到；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述氧化石墨烯GO水溶液中，氧化石墨烯GO与水的质量体积比为0.4g～0.6g:200mL；
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述GO/Fe3O4磁性纳米材料、蒸馏水、EDC、NHS的质量体积比为100mg﹕100mL﹕100～120mg﹕80～100mg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，超声均质处理具体为：将活化的GO/Fe3O4在频率为40kHz、功率为400W条件下超声均质处理30min；
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述PE降解酶与活化的GO/Fe3O4的质量比为1﹕99、2﹕98、3﹕97、4﹕96或5﹕95。
7.如权利要求1
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(A)中，所述发酵培养基为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾0.7g，磷酸氢二钾0.7g,七水硫酸镁0.7g，硝酸钠2.0g，氯化钠0.005g，七水硫酸亚铁0.002g，七水硫酸锌0.002g，硫酸锰0.001g，去离子水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min；
9.如权利要求1～8任一项所述方法制备得到的交联酶制剂。
10.权利要求9所述的交联酶制剂在降解塑料中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效降解塑料的交联酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述氨-硝酸铵缓冲液为将氨水和硝酸铵按摩尔比为2﹕1混合后，用质量浓度为25％的浓氨水滴加至ph为10得到；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述氧化石墨烯go水溶液中，氧化石墨烯go与水的质量体积比为0.4g～0.6g:200ml；
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述go/fe3o4磁性纳米材料、蒸馏水、edc、nhs的质量体积比为100mg﹕100ml﹕100～120mg﹕80～100mg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，超声均质处理具体为：将活化的go/fe3o4在频率为40khz、功率为400...
【专利技术属性】
技术研发人员：王欢莉，丁嘉骏，赵雅婷，刘胜楠，王云岩，孙馨，范忠军，夏文龙，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：
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