【技术实现步骤摘要】
本公开总体上涉及复合化学领域，并且更具体地涉及化合物卤化的生物催化。
技术介绍
1、卤化天然产物的流行已经促进了在了解参与次级代谢的各种类型的卤化酶方面的重大进步。到目前为止，大多数表征的卤化酶可以分为三类：卤过氧化物酶(含血红素且含钒)、非血红素fe(ii)α-酮戊二酸依赖性酶和黄素依赖性酶。卤过氧化物酶通常是非选择性的并通过利用自由扩散的次卤酸的机制执行卤化。相比之下，fe(ii)α-酮戊二酸依赖性卤化酶通过自由基机制，通常为卤化脂肪族未活化的碳1进行。黄素依赖性卤化酶(fdh)也通过次卤酸中间体进行，其中反应性试剂被表现为控制芳香族底物2,3上的卤化的区域选择性的赖氨酸残基捕获。fdh衍生的次卤酸是通过黄素c4a-过氧化物加合物与结合的氯离子之间的反应生成的。fdh被认为是通过亲电芳香族取代(eas)进行的，其中催化赖氨酸残基提供氯胺卤化剂，并且催化谷氨酸通过使在催化2期间产生的带正电的中间体去质子化来促进反应。
2、大部分先前表征的fdh是细菌来源的，其中从真核生物中报告的相对较少4-12，并且仍然以生物化学表征的更少4-6,10-12。已经发现细菌fdh在天然产物生物合成中催化游离的底物2,13-15和结合载体蛋白的底物16,17(包含前体氨基酸)两者上的反应。良好表征的真核生物fdh rdc24和chla6催化卤化代谢物的生物合成中的后期c-h官能化反应。然而，尚未报告这两种酶的结构数据，并且尚不清楚所述两种酶如何控制在大的、结构复合的底物上的位点选择性卤化。
3、畸枝霉酰胺(malbranc
4、在阐明畸枝霉酰胺的生物合成途径的早期努力中，在金色畸枝霉中执行前体掺入研究。由此得出结论，前畸枝霉酰胺(premalbrancheamide)(化合物2)确实掺入一氯化畸枝霉酰胺b(化合物3)中，并且两种化合物均为金色畸枝霉的天然代谢物25。先前已经提出在c8官能化以产生畸枝霉酰胺(化合物1)25之前，对c9位置进行位点选择性氯化。然而，使c8(异畸枝霉酰胺(isomalbrancheamide)b(化合物4))和c9(畸枝霉酰胺b(化合物3))单卤化代谢物与金色畸枝霉20和禾本畸枝霉19分离与提出的c9选择性假设相冲突。
5、通过合成方法选择性地卤化高度复合分子中的c-h键的能力由于化学上等效的c-h键的丰度以及无法克服固有的空间或电子反应性偏向31,32而提出了巨大的挑战。通过定制酶来进行后期官能化的大量生物活性天然产物为利用卤化酶的能力执行困难的化学转化提供了独特的机会。
6、鉴于上述观察，本领域仍然需要修饰复合化合物的催化剂，例如如吲哚生物碱等复合化合物的受控卤化。
技术实现思路
1、本公开提供了作为真菌mala或mala'卤化酶的氨基酸变体的具体可用于使如吲哚生物碱等复合化合物卤化的黄素依赖性卤化酶(fdh)。这些酶可用于在真菌畸枝霉酰胺途径中产生多种卤化化合物，所述化合物在哺乳动物中具有生理作用，如抑制钙调蛋白，并由此调节一系列多样的生理途径中涉及的钙离子信号传导途径，并且因此调节各种疾病或病症。包括施用有效量的本文所公开的化合物的示例性方法包含抑制哺乳动物中的平滑肌收缩。
2、在一方面，本公开提供了一种黄素依赖性卤化酶(fdh)变体，其与seq id no:2或seq id no:4中所示的氨基酸序列相比包括一个或两个氨基酸取代，其中所述fdh变体能够催化复合有机化合物的卤化。在一些实施例中，所述复合有机化合物是芳香族杂环有机化合物。在一些实施例中，所述芳香族杂环有机化合物包括双环[2.2.2]二氮杂辛烷环。在一些实施例中，所述芳香族杂环有机化合物包括吲哚。在一些实施例中，所述化合物是吲哚生物碱。在一些实施例中，所述吲哚生物碱是异戊烯基化吲哚生物碱。在一些实施例中，所述fdh变体源自真菌fdh。在一些实施例中，所述fdh变体源自细菌fdh。在一些实施例中，所述fdh变体不源自真菌fdh或细菌fdh。
3、在一些实施例中，所述fdh变体是mala卤化酶变体。在一些实施例中，所述fdh变体包括seq id no:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为s129z、h253z、s129z/h253z、d109z、f489z、s409z、w265z、w263z、s82z、s129z/g131z、g131z、s129z/i493z、i493z、s129z/p85z或p85z，其中z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。在本公开的上下文中，处于氨基酸水平的取代突变或变异被明确定义为包含任何天然存在的常规氨基酸对不相同氨基酸的取代，或无氨基酸对给定氨基酸的取代，即，单个氨基酸缺失。在一些实施例中，所述fdh变体包括seq id no:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为s129a、h253f、s129a/h253f、h253a、d109a、f489h、s409a、w265a、w263a、s82a、s129a/g131s、g131s、s129a/i493s、i493s、s129a/p85s或p85s。在一些实施例中，所述mala卤化酶包括seq id no:6、8、12或16中所示的序列。在一些实施例中，所述fdh变体是mala'卤化酶变体。在一些实施例中，所述fdh变体包括seq id no:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代是e494z或h253z，其中z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。在一些实施例中，所述fdh变体包括seq idno:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为e494d、h253f、s129a、s129a/i493s、i493s、s129a/p85s、p85s、s129a/g131s或g13本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黄素依赖性卤化酶(FDH)变体，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列相比包括一个或两个氨基酸取代，其中所述FDH变体能够催化复合有机化合物的卤化。
2.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述复合有机化合物是芳香族杂环有机化合物。
3.根据权利要求2所述的FDH变体，其中所述芳香族杂环有机化合物包括双环[2.2.2]二氮杂辛烷环。
4.根据权利要求2所述的FDH变体，其中所述芳香族杂环有机化合物包括吲哚。
5.根据权利要求4所述的FDH变体，其中所述化合物是吲哚生物碱。
6.根据权利要求5所述的FDH变体，其中所述吲哚生物碱是异戊烯基化吲哚生物碱。
7.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述FDH变体源自真菌FDH。
8.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述FDH变体源自细菌FDH。
9.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述FDH变体不源自真菌FDH或细菌FDH。
10.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述FDH变体是M
11.根据权利要求10所述的FDH变体，其中所述FDH变体包括SEQ ID NO:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为S129Z、H253Z、S129Z/H253Z、D109Z、F489Z、S409Z、W265Z、W263Z、S82Z、S129Z/G131Z、G131Z、S129Z/I493Z、I493Z、S129Z/P85Z或P85Z，其中Z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。
12.根据权利要求10所述的FDH变体，其中所述FDH变体包括SEQ ID NO:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为S129A、H253F、S129A/H253F、H253A、D109A、F489H、S409A、W265A、W263A、S82A、S129A/G131S、G131S、S129A/I493S、I493S、S129A/P85S或P85S。
13.根据权利要求10所述的FDH变体，其中所述MalA卤化酶包括SEQ ID NO:6、8、12或16中所示的序列。
14.根据权利要求1所述的FDH变体，其中所述FDH变体是MalA'卤化酶变体。
15.根据权利要求13所述的FDH变体，其中所述FDH变体包括SEQ ID NO:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代是E494Z或H253Z，其中Z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。
16.根据权利要求13所述的FDH变体，其中所述FDH变体包括SEQ ID NO:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为E494D、H253F、S129A、S129A/I493S、I493S、S129A/P85S、P85S、S129A/G131S或G131S。
17.根据权利要求14所述的FDH变体，其中所述MalA'卤化酶包括SEQ ID NO:10、14或18中所示的序列。
18.一种多核苷酸，其对根据权利要求1所述的FDH变体进行编码。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中经过编码的FDH变体是MalA卤化酶变体或MalA'卤化酶变体。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述经过编码的FDH变体包括SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16或18中所示的序列。
21.一种载体，其包括根据权利要求18所述的多核苷酸。
22.一种宿主细胞，其包括根据权利要求18所述的多核苷酸或根据权利要求21所述的载体。
23.一种畸枝霉酰胺(malbrancheamide)D化合物，其包括式I：
24.一种异畸枝霉酰胺(isomalbrancheamide)D化合物，其包括式II：
25.一种畸枝霉酰胺E化合物，其包括式III：
26.一种使复合有机化合物卤化的方法，所述方法包括在适于对复合有机化合物进行酶催化卤化的条件下使所述复合有机化合物与根据权利要求1所述的FDH卤化酶变体以及卤素接触。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述复合有机化合物是芳香族杂环有机化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述芳香族杂环有机化合物包括双环[2.2.2]二氮杂辛烷环。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述芳香族杂环有机化合物包括吲哚。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述化...
【技术特征摘要】
1.一种黄素依赖性卤化酶(fdh)变体，其与seq id no:2或seq id no:4中所示的氨基酸序列相比包括一个或两个氨基酸取代，其中所述fdh变体能够催化复合有机化合物的卤化。
2.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述复合有机化合物是芳香族杂环有机化合物。
3.根据权利要求2所述的fdh变体，其中所述芳香族杂环有机化合物包括双环[2.2.2]二氮杂辛烷环。
4.根据权利要求2所述的fdh变体，其中所述芳香族杂环有机化合物包括吲哚。
5.根据权利要求4所述的fdh变体，其中所述化合物是吲哚生物碱。
6.根据权利要求5所述的fdh变体，其中所述吲哚生物碱是异戊烯基化吲哚生物碱。
7.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述fdh变体源自真菌fdh。
8.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述fdh变体源自细菌fdh。
9.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述fdh变体不源自真菌fdh或细菌fdh。
10.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述fdh变体是mala卤化酶变体。
11.根据权利要求10所述的fdh变体，其中所述fdh变体包括seq id no:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为s129z、h253z、s129z/h253z、d109z、f489z、s409z、w265z、w263z、s82z、s129z/g131z、g131z、s129z/i493z、i493z、s129z/p85z或p85z，其中z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。
12.根据权利要求10所述的fdh变体，其中所述fdh变体包括seq id no:2中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为s129a、h253f、s129a/h253f、h253a、d109a、f489h、s409a、w265a、w263a、s82a、s129a/g131s、g131s、s129a/i493s、i493s、s129a/p85s或p85s。
13.根据权利要求10所述的fdh变体，其中所述mala卤化酶包括seq id no:6、8、12或16中所示的序列。
14.根据权利要求1所述的fdh变体，其中所述fdh变体是mala'卤化酶变体。
15.根据权利要求13所述的fdh变体，其中所述fdh变体包括seq id no:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代是e494z或h253z，其中z是在指示位置处不存在氨基酸或存在除了野生型氨基酸之外的任何常规氨基酸。
16.根据权利要求13所述的fdh变体，其中所述fdh变体包括seq id no:4中所示的序列的氨基酸取代变体，其中取代为e494d、h253f、s129a、s129a/i493s、i493s、s129a/p85s、p85s、s129a/g131s或g131s。
17.根据权利要求14所述的fdh变体，其中所述mala'卤化酶包括seq id no:10、14或18中所示的序列。
18.一种多核苷酸，其对根据权利要求1所述的fdh变体进行编码。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中经过编码的fdh变体是mala卤化酶变体或mala'卤化酶变体。
20.根据权利要求19所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·H·舍尔曼，A·E·弗拉利，A·特里帕蒂，
申请(专利权)人：密歇根大学董事会，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。