【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肺炎支原体检测领域，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法。
技术介绍
1、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,mp)是介于细菌和病毒之间能独立生活的最小病原微生物，无细胞壁[1]。肺炎支原体感染有多种临床表现，轻症的感染者仅表现阵发性刺激性干咳、发热、呼吸音粗；重症感染可引起支气管肺炎、胸腔积液、肺实变、肺脓肿等，可涉及神经系统、泌尿系统、心血管系统、血液系统、肠胃道系统、皮肤黏膜、关节和肌肉病变[2]。据报道，社区获得性肺炎病例中有10％至40％为肺炎支原体感染，儿童是最易感染mp的人群[3]。有研究发现在哮喘高危儿童中，肺炎支原体感染可诱发哮喘发作。gendrel等[4]对因严重哮喘发作并伴持续性低氧血症而住院的儿童进行了调查，显示26％的有哮喘病史的儿童和50％的以哮喘发作为主要表现的儿童发现了支原体感染。此外，如果支原体感染不典型，则在一个月内会再次出现哮喘发作，因此肺炎支原体不仅被视为儿童呼吸道感染的主要病原体，而且还是哮喘恶化甚至开始的触发因素。
2、目前支原体分离培养是确定mp感染的可靠方法，但该法检测时间长、操作繁琐且阳性率低，不能用于常规检测[5]。除此之外，包括补体结合实验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等在内的血清学检测也是支原体临床检测常用的方法[6]，一般要求同时测定igg和igm，但临床难以得到双份血清，且在感染早期及免疫损害患儿会出现假阴性导致误诊，mp感染后高滴度抗体可在感染后保持数月，因而难以区别现症感
3、因此，亟需开发一种廉价、操作简捷、准确、特异性强、灵敏度高的检测方法。
4、重组酶聚合酶扩增技术(rpa)在22～45℃范围内进行，且不需要温度控制，并能够在20分钟内扩增低至1～10个dna目标拷贝，被认为是一种可以替代pcr的新型核酸扩增技术，已被用于扩增多种靶标，包括rna、mirna、ssdna和dsdna来自各种生物体和样品[8]。crispr首先在细菌基因组中被发现是对噬菌体的免疫武器，现已成为基因工程的基石。crispr/cas12a酶属于crispr-cas中的2类系统[9]，它能识别富含胸腺嘧啶(thymine,t)核苷酸的间隔区相邻基序(pam)，催化它们自身的指导crispr rna(crrna)成熟，一旦cas12a与crrna以及靶标dna形成三元复合体后，该复合物就会显示出很强的“乱切”活性，并将体系中任意单链dna切成碎片(称为trans切割)[10,11]，通过荧光信号的释放提示靶标基因存在，从而推断样品中是否含有待检的病原体。
技术实现思路
1、为解决上述背景中的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于rpa-crispr/cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法。
2、为实现本专利技术的目的，提供了以下实施方案：
3、(1)ncbi查找所有可获得的肺炎支原体的p1基因dna序列；
4、(2)采用snapgene软件进行序列比对，获得p1基因保守序列；
5、(3)利用ncbi中primer-blast设计特异性rpa引物对，即seq id no:1-10；
6、(4)基于引物对设计crrna序列，并利用blast检查序列特异性，即seq id no:11-13；
7、(5)待测菌培养后离心获得菌体或者临床样本(肺液、痰液和肺泡灌洗液等)利用裂解液快速获得rpa模板，进行浓度测定；
8、(6)采用rpa扩增引物对进行rpa扩增，纯化后的rpa产物即crispr/cas12a系统模板，琼脂糖电泳以确定最佳引物对；
9、(7)crispr/cas12a系统：将(6)中所述rpa产物、crrna、探针、cas12a蛋白及缓冲液配制成20μl反应体系进行反应；
10、(8)反应结束后利用侧向流动试纸条检测结果；
11、(9)控制变量法调节反应温度、时间和探针浓度建立最佳rpa-crispr/cas12a反应体系；
12、(10)通过实验室小样本和临床大量样本进行特异性、灵敏度、重复性和临床适用性实验，评估本专利技术rpa-crispr/cas12a系统检测肺炎支原体可视化方法。
13、本专利技术的基于rpa-crispr/cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，包括核酸快速裂解液、肺炎支原体p1基因rpa引物对、rpa反应缓冲液、cas12a、crrna、dna探针和侧向流动试纸条。
14、所述裂解液方案为：
15、①50mm tris(ph＝8.0)，150mm nacl，2％ pvp，1％ tween-20；
16、②800nm盐酸胍，50mm tris(ph＝8.0)，0.5％ triton-x100，1％ tween-20；
17、③1.5m盐酸胍，50mm tris(ph＝8.0)，100nm nacl，5mm edta，1％ tween-20。
18、所述rpa引物对如下表：
19、
20、所述crrna及探针序列如下表：
21、
22、在一具体实施方案中，上述专利技术中的核酸快速裂解液裂解结果比较，第三种方案获得的肺炎支原体完整基因组电泳检测条带清晰、拖带现象少，且nanodrop测定核酸浓度整体较高，更适合后续rpa-crispr/cas12a检测系统开发。
23、在一具体实施方案中，利用上述专利技术中的seq id no:1-10进行rpa，反应产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示引物对1、2、5(即seq id no:1-4、seq id no:9-10)均能扩增出肺炎支原体p1序列片段且条带清晰，引物对4(即seq id no:7-8)的目标条带不够明亮，而引物对3(即seq id no:5-6)未观测到目标条带。
24、优选的是，利用上述引物对1对肺炎支原体进行扩增时，所用反应体系为：缓冲液25μl、上下游引物(10μm)各2μl、dna模板1μl、rnase抑制剂0.5μl，用depc处理水补充至47μl，短暂混匀后反应管管盖上加3μl醋酸镁启动剂，短暂离心后进行rpa反应。
25、在一具体实施方案中，利用上述rpa扩增体系，改变反应温度为：37、39、41℃，改变反应时间为15，25，30min，综合检测诉求考虑，优选的是，rpa反应条件为39℃15min。
26、优选的是，crispr/cas12a反应系统检测时，所用体系为10×cas12a buffer 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，其特征在于，核酸快速提取裂解液；
2.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，其特征在于，所述检测系统包括RPA扩增引物对、探针、crRNA序列设计；
3.根据权利要求书2所述crRNA1是基于SEQ ID NO:1-4设计，crRNA2是基于SEQ ID NO:5-8设计，crRNA3是基于SEQ ID NO:9-10设计。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法在检测肺炎支原体中的应用。
5.根据权利要求4，所述的应用，其特征在于，所述可视化检测肺炎支原体方法包括以下步骤：
6.其中，步骤（5）中所述RPA反应需通过琼脂糖凝胶电泳检测筛选出最佳RPA引物对。
7.基于RPA-CRISPR/Cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，含权利要求书1-3可用于制备检测肺炎支原体试剂盒。
【技术特征摘要】
1.一种基于rpa-crispr/cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，其特征在于，核酸快速提取裂解液；
2.一种基于rpa-crispr/cas12a系统的肺炎支原体可视化检测方法，其特征在于，所述检测系统包括rpa扩增引物对、探针、crrna序列设计；
3.根据权利要求书2所述crrna1是基于seq id no:1-4设计，crrna2是基于seq id no:5-8设计，crrna3是基于seq id no:9-10设计。
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