发酵萎缩芽孢杆菌制备Ｂａｃｉｌｌａｍｉｄｅ　Ｃ的培养基及其制备及应用方法技术

一种细菌培养技术领域的发酵萎缩芽孢杆菌制备Ｂａｃｉｌｌａｍｉｄｅ?Ｃ的培养基及其制备及应用方法，该培养基的组分及含量为：３．６４ｇ／Ｌ玉米淀粉、６．０ｇ／Ｌ胰蛋白胨、６．２９ｇ／Ｌ碳酸钙、４．０ｇ／Ｌ大豆蛋白胨、０．１０ｇ／Ｌ半胱氨酸和０．０２ｇ／Ｌ色氨酸，溶剂为人工海水。本发明专利技术不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵罐发酵大量制备Ｂａｃｉｌｌａｍｉｄｅ?Ｃ的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种细菌培养
的培养基及其制备，具体是一种发酵萎缩 芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法。
技术介绍
与陆地生物相比，海洋生物生活于高盐、高压、低温、稀营养等条件严苛的环境中。 为求生存，很多海洋生物在长期的进化过程中产生一些结构独特的化学物质。从海洋生物 中已发现多种活性物质，包括抗肿瘤化合物、肿瘤促进剂、抗炎症/过敏化合物、抗菌、抗病 毒化合物、生物毒素、抗寄生虫化合物、多不饱和脂肪酸等，其中相当部分生物活性物质是 陆地生物所没有的。这些海洋生物活性物质具有种类繁多、结构特异复杂等特点。在众多 海洋生物中，海绵是目前发现活性物质最丰富的海洋生物之一，人们对海绵活性物质寄予 极大的希望，但海绵体内的活性物质含量很低，捕捞海绵资源有限，药源的供给不足使得海 绵药物开专利技术显滞后。为寻找稳定可靠的药源，进行大规模生产，开展相关海绵共附生微生 物的研究是迫切而重要的工作。经过对现有技术的检索发现，于璐璐等(Lu-Lu Yu et al.，Helvetica Chimica Acta2009 ；92 607-611)从来自中国南海的贪婪倔海绵萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus C89菌液的乙酸乙酯萃取物中，分离到一种结构较新的化合物Bacillamide C。 Bacillamides家族化合物及其衍生物已被证实对多环旋沟藻、蓝藻和微藻有不同程度的抑 制作用。藻类引起的赤潮和水华对生态、经济和人类健康的威胁日益严重，因而该家族作为 潜在的抑藻剂有很高的研究价值和应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述缺点，提供一种发酵萎缩芽孢杆菌制备 Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法，不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵 罐发酵大量制备Bacillamide C的要求。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及一种用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其组分及含量为3.64g/L玉米淀 粉、6. Og/L胰蛋白胨、6. 29g/L碳酸钙、4. Og/L大豆蛋白胨、0. 10g/L半胱氨酸和0. 02g/L色 氨酸，溶剂为人工海水。所述的人工海水的组份及含量为26. 518g/L的NaCl、2. 447g/L的MgCl2、3. 305g/ L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr， 溶剂为Millpore超纯水，该人工海水的pH 7. 0-7. 2。本专利技术涉及上述用于萎缩芽孢杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤第一步、配制人工海水分别将NaCl、MgCl2、MgS04、CaCl2、KCl、NaHC03 以及 NaBr 溶 解于超纯水中后进一步混合。第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加热煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大 豆蛋白胨和碳酸钙并搅拌溶解，然后进行高温杀菌得到培养基。所述的搅拌溶解过程中不断补充纯水补足玉米淀粉蒸煮过程中失去的水分。所述的高温杀菌是指在121°C环境下灭菌20分钟。本专利技术涉及上述培养基的应用方法，通过将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中 配成混合氨基酸溶液并采用过滤膜进行过滤，然后将所述培养基对发酵萎缩芽孢杆菌进行 发酵培养，在发酵培养过程中添加过滤后的混合氨基酸溶液，实现萎缩芽孢杆菌产量的优 化。所述的混合氨基酸溶液中含有半胱氨酸0. 10g/L以及色氨酸0. 02g/L。采用本专利技术方法成功的对萎缩芽孢杆菌产Bacillamide C的培养基成分进行了优 化。在摇瓶水平上，将菌种分别接种到基本培养基和最优培养基中，比较两种培养基中菌种 的生长情况和产Bacillamide C的情况。在最优培养基中发酵96h的Bacillamide C的产量达到22. 797mg/L，是在未优 化的基本培养基中产量(2.746mg/L)的8. 3倍。这表明，在摇瓶水平上，单菌产目标产物 的能力明显提高。之后使用最优培养基的成分配比在5L发酵罐上进行放大培养初试。由 于部分物理条件的改变，最大菌浓度进一步增至2. 385X 109/ml，是摇瓶发酵最大菌浓度 (1.78 XlOVml)的1.34倍。菌体生长期的缩短使得5L罐上发酵的总时长为72h，较之摇瓶 发酵所需的96h缩短了 24h，但5L罐上发酵72h的Bacillamide C产量为34. 80mg/L,是摇 瓶发酵96h Bacillamide C产量(22. 797mg/L)的1. 53倍，是培养基优化前2. 746mg/L的 12. 7倍。本专利技术所得到的培养基成分不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵罐发酵的 要求。附图说明图1萎缩芽孢杆菌发酵Bacillamide C产量在基本培养基和最优培养基中的对比 图。图2萎缩芽孢杆菌采用最优培养基在5L发酵罐上培养的发酵动态监测图。 具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施 例。以下实施例中涉及的Bacillamide C的具体为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus菌株(学名)，其保藏信息/公开获得渠道为该菌株16S rRNA序列与多株萎 缩芽孢杆菌的16S rRNA序列完全一致，萎缩芽孢杆菌在早稻田(北京)生物科技发展有限 公司销售。 1、四种基本培养基的配制。1)牛肉膏蛋白胨培养基10g胰蛋白胨，5g牛肉膏溶解于IL人工海水；2) LB培养基10胰蛋白胨，5g酵母膏溶解于IL人工海水；3)M2216培养基5g胰蛋白胨，Ig牛肉膏溶解于IL人工海水；44)自制培养基5g玉米淀粉用IL人工海水煮沸糊化，加入5g胰蛋白胨和5g大豆 蛋白胨，搅拌溶解，以适量的纯水补足玉米淀粉蒸煮过程中失去的水分至1L。加入5g碳酸 钙。以上四种培养基皆于121°C灭菌20min。分别以上述四种培养基进行发酵，菌种接种量为1 % (ν/ν)，在250mL三角瓶中装 液量IOOmL,在28°C、150rpm的恒温摇床中培养96h，pH自然。采用HPLC法测定Bacillamide C含量，以上四种培养基中Bacillamide C含量分 别为-.2. 414mg/L, 1. 860mg/L, 1. 306mg/L和2. 746mg/L。由此得到比较好的基本培养基配方 (配方1)为5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨，5g/L碳酸钙，人工海水配制， PH自然。以配方1进行发酵，Bacillamide C产量为2. 746mg/L。2、培养基中氨基酸前体的添加。在配方1的基础上，通过单因素实验确定半胱氨 酸、丙氨酸和色氨酸单独添加时的最佳时间和浓度。对每种氨基酸，分别于发酵起始、迟滞 期末、对数期中期、稳定期起始、稳定期开始后20h、稳定期开始后40h单独添加到IOOml发 酵液中，添加浓度为100mg/L发酵液，测定Bacillamide C产量的变化。而后在最佳添加时 间的基础上，对每种氨基酸分别用20mg/L发酵液、60mg/L发酵液、100mg/L发酵液、140mg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其特征在于，其组分及含量为：３．６４ｇ／Ｌ玉米淀粉、６．０ｇ／Ｌ胰蛋白胨、６．２９ｇ／Ｌ碳酸钙、４．０ｇ／Ｌ大豆蛋白胨、０．１０ｇ／Ｌ半胱氨酸和０．０２ｇ／Ｌ色氨酸，溶剂为人工海水。

【技术特征摘要】
一种用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其特征在于，其组分及含量为3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸钙、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶剂为人工海水。2.根据权利要求1所述的用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其特征是，所述的人工海水 的组份及含量为=26. 518g/L 的 NaCl,2. 447g/L 的 MgCl2,3. 305g/L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr，溶剂为 Millpore 超纯 水，该人工海水的pH 7. 0-7. 2。3.一种根据权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、配制人工海水分别将NaCl、MgCl2、MgSO4, CaCl2, KC1、NaHCO3...

【专利技术属性】
技术研发人员：金靓婕，李志勇，张风丽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]