一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，包括（１）同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗体－抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和（２）反应剂和检测剂，用于通过ａｒｒａｙ－ＥＬＩＳＡ方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体－抗原反应的物质。本发明专利技术还公开了一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，该方法包括一将特异性抗体固定于底膜的步骤。本发明专利技术的试剂盒采用蛋白质芯片技术，能够检测四十项炎症因子，克服了的诸多缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种检测炎症因子的蛋 白质芯片试剂品.O
技术介绍
炎症是生物体排除有害刺激和促进愈合的一种自生保护性机制，其过程涉及复杂 的生化反应，这些有害刺激包括致病原、受损细胞或刺激物等。炎症一般表现为急性炎症和 慢性炎症，其中，急性炎症是身体对有害刺激物的最初反应，通过提高受损组织的血浆量和 白血球数得以实现，并伴随有一系列连锁生物反应，包括局部微循环、免疫系统和受损组织 内各种不同的细胞；而慢性炎症则会导致炎症处细胞逐渐变化，是损伤和愈合并存的过程， 可能持续数日、数月甚至数年，而且持久的慢性炎症的也会引起周边组织的损害。炎症可能引起多种人类疾病，包括过敏、哮喘、内脏疾病、关节炎和自身免疫性疾 病，研究发现，炎症可能引发其它慢性疾病，如心血管疾病、肥胖症、老年痴呆症、抑郁症和 癌症。其中，在在炎症过程中，肿瘤围绕肿块建立一个微环境，使癌细胞激增、扩散、转移、提 高癌细胞新成代谢。炎症的复杂生化反应过程有多种分子参与，其中，有一类分子在炎症过程中起到 促进作用，如白细胞介素ι α、白细胞介素ι β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、干扰素Υ、 转化促进因子β、粒状巨噬细胞、促进因子、白细胞介素11、白细胞介素12、白细胞介素17。 另一类分子则对抗炎症有抑制作用，这类分子包括白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介 素13、白细胞介素16、溶解性肿瘤坏死因子受体，当然还有其他趋化因子也参与炎症过程。 不同疾病具有不同的炎症因子，而检测这些炎症因子的表达水平不仅能帮助我们了解疾病 的发生、发展机制，也能帮助我们找到疾病的特殊靶标记和个体医疗生物标志。目前常用的炎症因子检测方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)，放射免疫分 l/f (radio immunoassay, RIA),(western blot), ^iffllfift (Flow-Cytometry) 等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点。但 一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的炎症因子检测中，该方 法存在明显的不足；放射免疫分析(RIA)虽然灵敏度高，是由于具有放射性污染，现在已很 少采用；免疫印绩法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能 检测单一指标，不适合运用于炎症因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平上检测炎症分子 的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。因此，本领域技术人员开始尝试用蛋白质芯片的方法克服上述技术方案中存在的 不足，例如，现有技术中，采用液体芯片能够同时检测10至20类分子，但由于样品间容易发 生相互作用，影响检测结果，很难发展成高通量方法，且此方法中采用的设备结构复杂，不 易推广。有鉴于此，开发出一种新型的炎症因子检测试剂盒，克服现有技术中存在的不足， 实现炎症因子检测检测的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的炎症因子检测试剂盒，采用蛋白质芯片技术，能够检测四十项炎症 因子，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、 便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。为了解决上述技术问题，本专利技术提供的一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒， 包括(1)同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗 体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和(2)反应 剂和检测剂，用于通过array-ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体 发生抗体-抗原反应的物质。其中，其中所述特异性抗体为针对选自如下蛋白质之抗体嗜酸细胞活化趋化因 子(Ε0ΤΑΧΙΝ)，白细胞诱素-2 (E0TAXIN-2)，粒细胞集落刺激因子，(GCSF)，重组人粒巨噬细 胞集落刺激因子(GM-CSF)，细胞间粘附分子-1 (ICAM-I)，干扰素-、(IFN- γ )，活化人T细 胞-种基因产(1-309)，白细胞介素-la (IL-la)，白细胞介素(IL-Ιβ)，白细胞介 素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞 介素-6sR(IL-6sR)，白细胞介素-7(IL-7)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-IO(IL-IO)， 白细胞介素-11 (IL-Il)，白细胞介素-12p40(IL-12p40)，白细胞介素_12p70 (IL_12p70)， 白细胞介素-13(IL-13)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素_16 (IL-16)，白细胞介 素-17 (IL-17)，趋化因子干扰素诱导蛋白10 (IP-10)，趋化蛋白_1 (MCP-I)，趋化蛋 白-2(MCP-2)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，趋化因子CXCL9 (MIG)，巨噬细胞炎性蛋 白-1 α (ΜΙΡ-1 α )，巨噬细胞炎性蛋白_1 β (ΜΙΡ-1 β )，巨噬细胞炎性蛋白_1 δ (ΜΙΡ-1 δ )， 趋化因子(RANTES)，转化生长因子-β KTGF-β 1)，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，肿瘤坏死 因子-β (TNF-0)，s肿瘤坏死因子受体l(s 1顺1 1)，8肿瘤坏死因子受体2(8 TNFRII)，生 长因子-BB(PDGF-BB)，抑制因子金属蛋白酶组织抑制因子_2 (TIMP-2)，上述各种特异性抗 体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点。优选地，所述独立识别位点上固定有单一浓度的一种抗体，一种抗体以一种或者 一种以上的浓度分别固定于底膜形成一个或者一个以上独立识别位点。优选地，所述特异性抗体中的任意一种以0. 2ng 20ng的含量点样固定于所述独 立识别位点。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述特异性抗体为生物素标记的抗体；底膜 采用所述底膜为硝酸纤维素膜(nitrocellulose)、聚偏氟乙烯膜(PVDF)或者尼龙膜 (Polyamide)。反应剂包括抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶 液，且特异性抗体标记有生物素；另外，所述反应剂还包括用于识别生物素标记的抗生物素 蛋白链菌素(Str印tavidin)，所述抗生物素蛋白链菌素标记有辣根过氧化物酶(HRP)。另一方面，本专利技术的所有解决的技术问题还在于提供一种测炎症因子的蛋白质芯 片试剂盒的制备方法，该方法包括一将特异性抗体固定于底膜的步骤，该步骤包括(1)将50-500nl的含0. 5-100ng特异性抗体蛋白质的Tris缓冲液(含有0. 01-10g/100ml牛白蛋白)点样于底膜上，(2)将点样好的底膜放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2°C到8°C保存备用。其中，步骤⑴中采用全自动点样仪完成点样操作，各特异性抗体蛋白质芯片点 阵排布于所述底膜。优选地，所述底膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜或者尼龙膜。由于本专利技术的方法中，采用的底膜材料和点样液的优良特性，在结合本专利技术的蛋 白质芯片试剂盒在检测炎症本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测炎症因子的蛋白质芯片试剂盒，其特征在于包括：（１）同时固定有若干种特异性抗体的底膜，所述特异性抗体与炎症因子能够发生抗体－抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述底膜形成若干个独立识别位点；和（２）反应剂和检测剂，用于通过ａｒｒａｙ－ＥＬＩＳＡ方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体－抗原反应的物质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄若磐，
申请(专利权)人：黄若磐，广州瑞博奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]