本发明专利技术公开了一种属于酪蛋白分离技术领域的αｓ－酪蛋白的分离方法。该方法以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，依据κ－酪蛋白为非Ｃａ２＋敏感性酪蛋白，可溶于含钙离子的溶液中而将κ－酪蛋白与αｓ－、β－酪蛋白分离，然后根据β－酪蛋白和α－酪蛋白在不同浓度的尿素溶液中溶解性不同的特点，通过调节溶液中尿素的浓度将二者分离。本方法操作简单易行，只需常规设备即可，用时仅约２～３ｈ，获得αｓ－酪蛋白组分回收率高，纯度可达到９７．８％，使用本方法进行乳酪蛋白的深加工，获得的αｓ－酪蛋白可用水解获得相应的乳源生物活性肽，从而使产品中的目标活性肽比例大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酪蛋白分离技术，具体涉及一种αs-酪蛋白的分离方法。该方法以牛乳干酪素为原料，采用化学分级分离法将其中主要成分αs-酪蛋白分离，同时可有效分离β-酪蛋白组分。
技术介绍
干酪素(casein，Cn)，又称为酪蛋白，包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白(β-Cn)和κ-酪蛋白(κ-Cn)，其中αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白又统称为αs-酪蛋白(αs-Cn)，αs-Cn约占到干酪素总量的47％。是乳源生物活性肽的重要来源。αs-酪蛋白中丰富的磷酸基含量，使其成为制备促进人体钙吸收的酪蛋白磷酸肽(CPP)的最优原料。αs-酪蛋白产品有良好的起泡性，可用作食品添加剂应用于食品生产，改善食品的性状。高纯度的食品级αs-酪蛋白产品，经水解后，可用于改善奶酪的风味，生产保健品及一些乳源生物活性肽的原料，现今在αs-酪蛋白的水解物中已发现了抗菌肽、抗高血压肽、免疫肽、阿片肽及促进矿物组织吸收的生物活性肽。此外，αs-Cn水解物中也能提供促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等各种功能肽，其中一些功能肽已经进行了商业化生产。现今，上述乳源活性肽的生产原料多是干酪素，制备的肽浓度低，杂质含量高，需要进一步浓缩纯化，费时费力。若直接以αs-酪蛋白为底物水解制备生物活性肽，将可以有效减少后续富集浓缩流程，提高目标肽的浓度。因此，快速有效的分离制备高纯度食品级αs-Cn对于乳源活性肽的生产意义重大，有利于干酪素的工业化深加工和资源利用。 酪蛋白各组分分离的方法通常可分为三类，第一，化学沉淀法，根据酪蛋白各组分在不同条件下溶解度不同而分离；第二，色谱法，该技术适于酪蛋白组分的定性和定量分析检测，如离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)或者反相高效液相色谱(Re-HPLC)等技术，但这些技术主要用于科学研究领域，不适于大规模的工业制备，并且分离所用的缓冲液中会加入某些有毒的还原剂，因此色谱法一般不用作食品级原料的分离；第三，低温过滤法，根据酪蛋白中β-酪蛋白(β-Cn)组分的温度依赖性及酪蛋白各组分分子量不同，主要通过微滤法和超滤法进行分离。该方法主要用于β-酪蛋白的分离制备，对低温条件要求严格，由于低温会导致溶液粘度增大而降低流速，从而降低了效率，且所得酪蛋白组分纯度不理想，应用受到限制，已渐被取代。综上所述，化学沉淀法条件温和，操作简单易行，可以大批量制备，该法在酪蛋白组分分离中存在明显优势。专利技术名称为Methods of ectracting casein fractions from milk andcaseinates and production of novel products，申请号为PCT/GB2002/003098的专利中关于酪蛋白组分αs-酪蛋白的化学分离方法采用了Ca2+-低温沉淀法。即在碱性pH条件下通过调整钙盐的浓度及低温沉淀等环节，从牛奶或干酪素中分离αs-酪蛋白和β-酪蛋白，并可同时获得富含κ-酪蛋白的组分，可用以加工CMP。该方法的路线图见图1。另外，PostAE(PostAE，Ebert M，et al，β-casein as a bioactive precursor-processing for purification，The AustralianJournal of Aairy Technology，2009，6484-88)等人验证并优化该方法，发现β-酪蛋白低温溶解时间越长(大于2h)，αs-和β-酪蛋白分离效果越好。综上所述，该方法分离获得的αs-酪蛋白纯度较低，仅为61％～85％。此法更适于制备高纯度的β-酪蛋白，用时4h以上，要想获得更好的结果，需反复溶解和延长低温保温时间。专利技术名称为一种酪蛋白组分的分离方法及应用，申请号为200510096244.5的专利申请以乳或干酪素为原料，依据酪蛋白中α-酪蛋白(包括αs-、κ-酪蛋白)和β-酪蛋白(β-Cn)在不同浓度尿素溶液中溶解性不同而进行分离。具体路线图见图2。该方法步骤较繁琐，经过两次溶解沉淀和水洗，耗时较长，总用时约4h，所得α-酪蛋白得率为69.5％，纯度仅为74.2％，β-酪蛋白得率为26.5％，纯度仅为75.0％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种αs-酪蛋白的分离方法。该方法是以牛乳干酪素为原料，采用化学分级分离法将其中主要成分αs-酪蛋白组分分离制取，并同时分离制备β-酪蛋白组分。 本方法的原理为首先依据κ-酪蛋白(κ-Cn)为非Ca2+敏感性酪蛋白，可溶于含钙离子的溶液中而将κ-Cn与αs-、β-Cn分离，然后根据β-酪蛋白(β-Cn)和α-酪蛋白在不同浓度的尿素溶液中溶解性不同的特点，通过调节溶液中尿素的浓度将二者分离。 一种αs-酪蛋白的分离方法，以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，具体操作步骤如下 (1)配制质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，并调节pH值至11.0，静置1-5min； (2)然后向酪蛋白水溶液中加入CaCl2至Ca2+浓度达0.04-0.06mol/L，调节pH值至7.0，离心收集沉淀，沉淀为αs-Cn和β-Cn的混合物； (3)将沉淀溶于6.6mol/L尿素水溶液中，然后加水稀释使溶液中尿素的浓度为3.3mol/L，调节pH值至4.6，离心并收集沉淀，沉淀经水洗2-3次，冷冻干后得αs-酪蛋白； (4)将步骤(3)离心后的上清液加水稀释，使其尿素浓度至1.6-1.8mol/L，调节pH至4.6，离心收集沉淀，沉淀经水洗2-3次、干燥后得β-酪蛋白。 步骤(3)中所述6.6mol/L尿素水溶液中含有浓度为1.8mol/L的NaCl。 上述方法中调节pH值采用1～5mol/L NaOH溶液和1～5mol/L HCl溶液； 上述步骤(3)中稀释尿素溶液用水为蒸馏水或去离子水； 所述步骤(3)和(4)中沉淀水洗的次数优选为2-3次。 本专利技术的有益效果本方法操作简单易行，无需低温，流程中涉及的试剂和药品种类少，只需常规设备即可，用时仅约2～3h，获得αs-酪蛋白组分回收率高，约占酪蛋白中α-酪蛋白总量的80％以上，纯度可达到97.8％，使用本方法进行乳酪蛋白(干酪素)的深加工，获得的αs-酪蛋白可用水解获得相应的乳源生物活性肽，从而使产品中的目标活性肽比例大大提高。该方法适合工业化生产，有利于牛乳酪蛋白的开发利用，具有很好的应用前景。 将采用本专利技术方法获得的αs1-酪蛋白配制成水溶液，通过胰蛋白酶水解，水解液分别经10KD、3KD的超滤膜超滤后，收集滤过液(＜3KD)并冷冻干燥，得αs-酪蛋白肽粉末(＜3KD)，将该粉末配制成15mg/mL水溶液，该溶液经反向高效液相色谱分析，经样品出峰时间与标准物比对，证明水解物中含有αs1-酪蛋白f(91-100)活性肽。 附图说明 图1为本专利技术实施例1的流程图； 图2为本专利技术方法中各分离步骤中间产物及最终产物的SDS-PAGE电泳图谱。 MMarker；1αs-Cn标准品；2β-Cn标准品；3干酪素；4步骤(2)离心后的上清液；5步骤(2)收集的沉淀物；6步骤(3)离心后的上清液；7步骤(3)离心后的沉淀物。 具体实施例方式 实施例1 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种α↓［Ｓ］－酪蛋白的分离方法，以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，其特征在于，按照如下操作步骤进行：（１）配制质量－体积百分比浓度为２．７％的酪蛋白水溶液，并调节ｐＨ值至１１．０，静置１－５ｍｉｎ；（２）然后向酪蛋白水溶液中加入ＣａＣｌ↓［２］至Ｃａ↑［２＋］浓度达０．０４～０．０６ｍｏｌ／Ｌ，调节ｐＨ值至７．０，离心收集沉淀；（３）将沉淀溶于６．６ｍｏｌ／Ｌ尿素水溶液中，然后加水稀释使溶液中尿素的浓度为３．３ｍｏｌ／Ｌ，调节ｐＨ值至４．６，离心并收集沉淀，沉淀经水洗２－３次，冷冻干后得α↓［Ｓ］－酪蛋白；（４）将步骤（３）离心后的上清液加水稀释，使其尿素浓度至１．６～１．８ｍｏｌ／Ｌ，调节ｐＨ值至４．６，离心收集沉淀，沉淀经水洗２－３次、干燥后得β－酪蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张列兵，刘晓辉，吴方旭，李妍，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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