本发明专利技术涉及一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法，将自行选育的抗酚发根农杆菌菌株的单菌落，在含卡那霉素的ＹＥＢ培养液中培养得经活化的菌液；选用含多酚类含量在２５％以下的的茶树品种的器官作为外植体，对外植体进行微伤预处理；对微伤预处理后的外植体在经活化的菌液中浸染；将浸染过的外植体经过共培养和脱菌培养获得茶树发根。本发明专利技术使发根农杆菌介导茶树进行遗传转化的发根频率从国内外研究的３０％左右提高到近６０％。这为发根农杆菌介导的遗传转化应用于茶树品种改良以及利用茶树发根培养生物合成儿茶素等次生代谢产物提供了一条有效途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法，属于植物基因工程
技术背景发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物遗传转化及转基 因研究的一种重要工具，而发根培养是生物合成植物次生代谢产物的重要途径。茶树 (Camelliasinensis)是一种富含儿茶素等多酚类物质的多年生木本植物，大量研究表 明茶树中的这类多酚类物质具有明显的杀菌或抑菌作用.食品科学.2007(08).;王静，戚向阳，朱学良， 等.表没食子儿茶素没食子酸酯及其不同氧化级分的抑菌活性研究.天然产物研究与 开发.2008:杜晓，李宁，周茹娟，等.植物中分离的儿茶素类及其聚合物的抑菌作用. 四川农业大学学报.2005,23(3) :374-378]，这种抑菌作用以及茶树细胞的木质化结构将 直接或间接阻碍发根农杆菌对茶树的遗传转化，这也就是国内外利用发根农杆菌介导对 茶树进行遗传转化率极低，发根农杆菌介导茶树进行遗传转化的发根频率仅在30%左右 (遗传转化率和遗传转化的发根频率的区别？).茶叶科学.2006， 26(1) :1-10;奚彪，刘祖生，梁月 荣，等.发根农杆菌介导的茶树遗传转化.茶叶科学.1997，17(增刊)155-156. 4，5; Zebra M， Banerjee S， Mathur A K， et al. Induction of hairy roots in tea(Camellia sinensisL.) Current Science. 1996,70(1) :84-86.]及茶树转基因育种难以成功的主 要原因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传 转化的方法，该方法使发根农杆菌介导茶树进行遗传转化的发根频率较高。为发根农杆菌 介导的遗传转化应用于茶树品种改良以及利用茶树发根培养生物合成儿茶素等次生代谢 产物提供一条有效途径。 本专利技术提供的技术方案是一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的 方法，将自行选育的抗酚发根农杆菌菌株的单菌落，在含卡那霉素的YEB培养液中培养得 经活化的菌液；选用含多酚类含量在25%以下的的茶树品种的器官作为外植体，对外植体 进行微伤预处理；对微伤预处理后的外植体在经活化的菌液中浸染；将浸染过的外植体经 过共培养和脱菌培养获得茶树发根。 所述自行选育的抗酚发根农杆菌菌株通过下法得到将发根农杆菌菌株 (Agrobacterium rhizogenes)转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将 此活化菌液100 1涂布在含有茶多酚浓度为25-800 g/ml以及含卡那霉素的AB固体培 养基上进行抑菌培养24-48小时，挑取在200 g/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转 接到含200 g/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活化 的菌液100 ill分别涂布到含200、400、800和1000 y g/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的 AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行2-3次抗酚筛选直至获得在 800-1000 g/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。 所述含卡那霉素的YEB液体培养基由下法得到将lg酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白胨，0. 5gMgS04 7H^，5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，再用1NnaOH调节pH值至 7. 2，然后用蒸馏水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养基温度降至60°C以下加入经0. 22 y微 孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。 所述含卡那霉素AB固体培养基由下法得到将3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、 0. 5gMgS04 7H20、lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04 7H20、5g蔗糖和15g琼脂溶解到900ml 的蒸馏水中，用IN NaOH调节pH值至7.2，蒸汽灭菌，待培养基温度降至6(TC以下加入经 0. 22 微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml ;所述含卡那霉素AB液体培养基 由下法得到将3gK2HP04、lgNaH2P04、0. 15gKCl、0. 5gMgS04 7H20、 lgNH4Cl、0. 01CaCl2、2. 5mg FeS04*7H2(^P 5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，用IN NaOH调节pH值至7. 2，然后用蒸馏 水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养基温度降至6(TC以下加入经0. 22 y微孔滤膜过滤灭菌 的浓度100mg/ml卡那霉素1ml 。 所述茶多酚中儿茶素的含量》80%。 所述茶多酚含有咖啡因0. 26%，表没食子儿茶素2. 66%， dl_儿茶素0. 71 %，表 儿茶素2. 15%，表没食子儿茶素没食子酯62. 83%，没食子儿茶素没食子酯3. 03%，表儿茶 素没食子酯16. 79%。 所述外植体由下法得到取茶树种子用清水洗净.剥出外种皮，在75%乙醇中浸 泡lmin，用无菌水冲净乙醇，再用0. lwt% HgCl2消毒10min，无菌水冲洗5次，置于MS培养 基上1周后萌发，在MS培养基继续培育4-6周得到试管苗，取试管苗的器官(如根或茎) 作为外植体。所述经活化的菌液由下法得到挑取自选的抗酚发根农杆菌菌株单菌落，至含 lOOmgL—1卡那霉素的YEB培养液，于黑暗、25。C ， 120rpm摇床培养24 36h。 所述对外植体进行微伤预处理为在无菌条件下将其放入MSO培养液中，用120W， 40KHz的超声波清洗器，进行15min的超声波处理。 所述在经活化的菌液中浸染为在无菌条件下，将微伤预处理后的外植体细胞无 菌浸入经活化的菌液中，浸泡10-20min取出，用无菌滤纸吸干菌液。 所述共培养为将浸染过的外植体置于含IBA5. 0或NAAO. lmg/L的MS固体培养基 上，25°C ，黑暗下共培养24-48h。 所述脱菌培养为将共培养的外植体经无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸取表水后 移至含500mgL—1头孢霉素的1/2MS0固体培养基上培养，25°C ，在黑暗条件下脱菌培养，2_5d 转接一次，直到无菌斑为止。 本专利技术对微伤预处理后的外植体先进行预培养再在经活化的菌液中浸染；所述预 培养为将外植体切成8 12mm的茎段或(4 6) X (4 6) mm2叶盘外植体，在MS。培养基 上预培养l-3d。 本专利技术针对茶树属多年生木本植物及富含多酚类等特征及农杆菌介导的遗传转 化率极低的问题，运用自行选育的抗酚发根农杆菌菌株(如R1000AP)，选用含多酚类较低 的品种(如绿茶品种)及器官(根或茎)作外植体，配合对外植体细胞进行微伤预处理(如 萎凋或超声)，浸染以及共培养等措施，成功地建立了发根农杆菌Ri介导的茶树高效遗传 转化体系。利用这一转化体系，使发根农杆菌介导茶树进行遗传转化的发根频率从国内外 研究的30%左右提高到近60%。这为发根农杆菌介导的遗传转化应用于茶树品种改良以及利用茶树发根培养生物合成儿茶素等次生代谢产物提供了 一条有效途径。 具体实施例方式选育抗酚发根本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发根农杆菌介导茶树发根高频诱导与遗传转化的方法，将自行选育的抗酚发根农杆菌菌株的单菌落，在含卡那霉素的ＹＥＢ培养液中培养得经活化的菌液；选用含多酚类含量在２５％以下的的茶树品种的器官作为外植体，对外植体进行微伤预处理；对微伤预处理后的外植体在经活化的菌液中浸染；将浸染过的外植体经过共培养和脱菌培养获得茶树发根； 所述自行选育的抗酚发根农杆菌菌株通过下法得到：将发根农杆菌菌株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）转接到含卡那霉素的ＹＥＢ液体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌液１００μｌ涂布在含有茶多酚浓度为２５－８００μｇ／ｍｌ以及含卡那霉素的ＡＢ固体培养基上进行抑菌培养２４－４８小时，挑取在２００μｇ／ｍｌ茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转接到含２００μｇ／ｍｌ浓度茶多酚的含卡那霉素的ＡＢ液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液１００μｌ分别涂布到含２００、４００、８００和１０００μｇ／ｍｌ浓度的茶多酚的含卡那霉素的ＡＢ液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行２－３次抗酚筛选直至获得在８００－１０００μｇ／ｍｌ浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛清黎，刘仲华，李玲，施兆鹏，朱旗，杨新河，
申请(专利权)人：孝感学院，
类型：发明
国别省市：42[中国|湖北]
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