重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用，涉及一种微生物重组构建方法及应用。将杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶插入ｐＰＩＣ９Ｋ，构建出重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ，然后将重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株最优重组菌株，命名为ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ。所构建的毕赤酵母工程菌表达杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶活力为１１２５ＩＵ／ｍＬ，蛋白表达量为１．２２ｇ／Ｌ。该酶具有酸碱稳定性、热稳定性好及催化ｐＨ范围广等优点，在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β－葡聚糖酶，其最适反应ｐＨ为６．０，最适反应温度为５０℃，具有较好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物重组构建方法及其应用。技术背景P-葡聚糖是禾本科植物细胞壁多糖成分，它富含在大麦、黑麦、高粱、稻和小麦等作物 的胚乳细胞壁中，不同物种其含量、比例也不相同。早期研究认为大麦P-葡聚糖中含有连续 的P-1,3键；但越来越多的试验证明，大麦P-葡聚糖分子中不存在连续的P-1,3键，且|3-1，3键和 (3-l,4键的分布不是随机的。不同来源P-葡聚糖中I3-1，3键和I3-1,4键所占的比例也不尽相同，其 中卩-1,3键约占25% 30% (Stone, B. A., Clarke, A. E (1992). Chemistry and Biology of 1,3-P-Glucans. La Trobe Univesity Press. Strandberg, L., Enfors， S. ， (1991). Factors influencing inclusion body formation in the production of a flised protein in Escherichia coli. Appl.Environ.Microbiol. 57, 1669-1674)。 (3-葡聚糖具有高粘度，分为水溶性和水不溶性两种。 水溶性p-葡聚糖所占比例较大，与蛋白质结合的P-葡聚糖大都不溶于水，其中p-l，3键的含量 和糖的聚合度是影响水溶性的主要素。P-葡聚糖在水中溶解成为粘性溶液，其浓度愈高，粘 度愈大。高浓度p-葡聚糖会形成网结构，能够吸收其周围的水分子，从而降低周围环境的物 理特性。P-葡聚糖表层带负电荷，在溶液中极易与带正电荷的物质结合。此外，p-葡聚糖还 能吸附钙、锌、钠等金属离子以及有机质。p-葡聚糖在实际应用中存在一些负面影响。在制造麦芽汁过程中，由于大量高分子P-葡 聚糖存在，致使麦芽汁粘度增大，过滤困难；在发酵过程中过量的P-葡聚糖还会与蛋白质结 合，使酵母早期沉淀。在动物饲养中，存在于饲料中的P-葡聚糖由于自身的种种限制因素(高 粘性、高亲水性、高吸水活性及吸附性等)影响营养物质在动物体内的代谢，从而降低动物 对营养物质的吸收效率。因此研究能降解葡聚糖的葡聚糖酶具有非常重要的理论和现实意义。 p-l,3-l，4-葡聚糖酶作为一类重要的p-葡聚糖酶，主要来源于微生物，目前报道了60种不同种 类的真菌能产生降解非淀粉多糖的酶类。在杆菌、梭菌、纤维菌、真菌中都发现了0-1,3-1，4-葡聚糖酶，p-l，3-l，4-葡聚糖酶也存在于植物中，但人和动物体内却是缺乏的(WenT.N.,etal.A truncated Fibrobacter succingenes l，3-l,4-P-D-glucanase with improved enzymatic activity and thermotolerance.Biochemistry,2005,44:9197-9205)。同时由于天然来源的(3-葡聚糖酶产量小，稳定性低，而且天然野生菌株培养困难，无法实现大规模的工业应用；因此通过基因工程手 段构建高表达量重组工程菌越来越受到国内外的关注。P-l，3-l,4-葡聚糖酶应用于啤酒工业，它可分解大麦及麦芽中的P-葡聚糖凝胶，降低麦汁 粘度，提高麦汁的过滤速度、麦汁浸出率，减少胶状沉淀物，改善啤酒的混浊度，从而提高 产品质量。(3-葡聚糖酶在啤酒工业中的应用主要通过两个途径 一是添加外源P-葡聚糖酶， 刘妙莲等(刘妙莲，林宇野，王洁，王薇青.(3-葡聚糖酶(EC. 3.2. 1.73)的研究n.(i-葡聚 糖酶的性质及应用[J],食品与发酵工业，1989)将来自枯草芽孢杆菌(^^7/Mra6rito)的(3-葡聚糖酶制剂添加于麦芽汁中，降低了麦芽汁粘度，改善了啤酒质量；二是改良酿酒酵母， 黄兴奇等(黄兴奇，郑伟军，陈永青，宋大新.P-l,3-l，4-葡聚糖酶基因亚克隆研究，西南农业 学报，1990)将枯草芽孢杆菌C87/w甜6说/0中分离得到的P-l,3-l,4-葡聚糖酶基因克隆到 酿酒酵母(S.謂v她e)中，表达良好。Courtois等(Courtois,J.E., (1987). [Use of a filtration enzyme with dominant beta-glucanase activity produced by Disporotrichum dimorphosporum, in beer brewing]. Bull.Acad.Natl.Med.71， 693-694)克隆真菌的P-葡聚糖酶基因获得了一株酶分 解能力较高的改良酵母菌株，能使麦芽汁粘度降低，加速过滤，提高麦芽汁收率，啤酒质量 得到明显改善。在饲料添加剂方面，经研究发现，反刍动物能够借助肠胃中的瘤胃微生物产生的P-葡聚 糖酶消化利用p-葡聚糖，而单胃动物由于自身不具备合成(3-葡聚糖酶的微生物以及分解P-葡 聚糖的酶系，使食糜在肠道中具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜的充分混合，从而阻 止营养物质的吸收，降低了饲料的转化率，成为一种抗营养因子，限制了大麦等作物在词料 中的应用(Brenes， A., Smith, M., Guenter, W Marquardt, R. R. Effect of enzyme supplementation on the performance and digestive tract size of broiler chickens fed wheat- and barley-based diets[J]. Poult.Sci., 1993, (72): 1731-1739.)。自20世纪90年代起，人们对葡聚糖酶作为饲料添加剂做 了大量的研究。 一般地，在饲料中添加酶制剂是为了了提高饲料的饲用价值，减小营养成分 质量的差异，减小粪便的粘度等。在饲养中添加酶制剂后发现，消化性能好的和差的谷物之 间饲养效果差异减小，在存在酶的情况下，谷物中的营养含量高于没有酶存在的情况。Ji等 (Ji， F., Casper, D. P., Brown, P. K., Spangler， D. A.， Haydon， K. D.， Pettigrew， J. E. Effects of dietary supplementation of an enzyme blend on the ileal and fecal digestibility of nutrients in growing pigs [J]. J .Anim. Sci.， 2008， (86): 1533-1543)用大豆和大麦的混和词料饲养猪仔，在 饲料中添加P-葡聚糖酶后，干物质、粗蛋白和能量的消化率都直线增长。当添加葡聚糖酶含 量为0.2%时，粗蛋白的消化率从81.6%上升至88.5%，能量的消化率从85.2%升至89.5%。4Fang等(Fang, Z. F.， Liu， Z. L.， Dai, J. J., Qian, H. Y., Qi， Z. L.， Ma, L. B., Peng， J. Effects of enzyme addition on本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤： １）杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因的获取 从重组大肠杆菌ＸＭ－ＬＵ中提取质粒ｐＸＭＬｕ，以质粒ｐＸＭＬｕ为模板，设计引物如下： 上游引物ＢＧＬ１：５’－－ＣＧＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＣＴ－－３’， 下游引物ＢＧＬ２：５’－－ＡＴ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＣＴ－－３’， 在杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因两端分别引入ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｏｔ Ｉ两个酶切位点，ＰＣＲ扩增得大小为７１７ｂｐ的杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因； ２）巴斯德毕赤酵母表达载体的构建 将获得的杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｏｔ Ｉ双酶切，将双酶切后的杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因与经过ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｏｔ Ｉ双酶切的载体ｐＰＩＣ９Ｋ连接，连接产物转化感受态大肠杆菌ＪＭ１０９，得构建好的重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ； ３）杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶重组毕赤酵母的构建及筛选 将重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株重组菌株，即重组毕赤酵母工程菌。...
【技术特征摘要】
1.重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取从重组大肠杆菌XM-LU中提取质粒pXMLu，以质粒pXMLu为模板，设计引物如下上游引物BGL15’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，下游引物BGL25’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，PCR扩增得大小为717bp的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I双酶切，将双酶切后的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与经过EcoR I和Not I双酶切的载体pPIC9K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，得构建好的重组载体pPIC9K-bgl；3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，陈龙军，梁达奉，郭亭，敬科举，
申请(专利权)人：厦门大学，广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]
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