重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用制造技术

重组毕赤酵母工程菌的构建及其应用，涉及一种微生物重组构建方法及应用。将杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶插入ｐＰＩＣ９Ｋ，构建出重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ，然后将重组载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ线性化导入巴斯德毕赤酵母，经筛选得一株最优重组菌株，命名为ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ－ｂｇｌ。所构建的毕赤酵母工程菌表达杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶活力为１１２５ＩＵ／ｍＬ，蛋白表达量为１．２２ｇ／Ｌ。该酶具有酸碱稳定性、热稳定性好及催化ｐＨ范围广等优点，在酸性环境中的热稳定性大大高于单一的野生型β－葡聚糖酶，其最适反应ｐＨ为６．０，最适反应温度为５０℃，具有较好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物重组构建方法及其应用。技术背景P-葡聚糖是禾本科植物细胞壁多糖成分，它富含在大麦、黑麦、高粱、稻和小麦等作物 的胚乳细胞壁中，不同物种其含量、比例也不相同。早期研究认为大麦P-葡聚糖中含有连续 的P-1,3键；但越来越多的试验证明，大麦P-葡聚糖分子中不存在连续的P-1,3键，且|3-1，3键和 (3-l,4键的分布不是随机的。不同来源P-葡聚糖中I3-1，3键和I3-1,4键所占的比例也不尽相同，其 中卩-1,3键约占25% 30% (Stone, B. A., Clarke, A. E (1992). Chemistry and Biology of 1,3-P-Glucans. La Trobe Univesity Press. Strandberg, L., Enfors， S. ， (1991). Factors influencing inclusion body formation in the production of a flised protein in Escherichia coli. Appl.Environ.Microb本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　１）杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因的获取　　　　从重组大肠杆菌ＸＭ－ＬＵ中提取质粒ｐＸＭＬｕ，以质粒ｐＸＭＬｕ为模板，设计引物如下：　　　　上游引物ＢＧＬ１：５’－－ＣＧＧＡＡＴＴＣ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＴＴＧ　ＣＴ－－３’，　　　　下游引物ＢＧＬ２：５’－－ＡＴ　ＧＣＧＧＣＣＧＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＴＴＧ　ＣＴ－－３’，　　　　在杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因两端分别引入ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｎｏｔ　Ｉ两个酶切位点，ＰＣＲ扩增得大小为７１７ｂｐ的杂合β－１，３－１，４－葡聚糖酶基因；　　　　２...

【技术特征摘要】
1.重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的获取从重组大肠杆菌XM-LU中提取质粒pXMLu，以质粒pXMLu为模板，设计引物如下上游引物BGL15’--CG GAATTC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，下游引物BGL25’--AT GCGGCCGC ACC ATG AAA CGA GTG TTG CT--3’，在杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入EcoR I和Not I两个酶切位点，PCR扩增得大小为717bp的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因；2)巴斯德毕赤酵母表达载体的构建将获得的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I双酶切，将双酶切后的杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因与经过EcoR I和Not I双酶切的载体pPIC9K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，得构建好的重组载体pPIC9K-bgl；3)杂合β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组毕...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，陈龙军，梁达奉，郭亭，敬科举，
申请(专利权)人：厦门大学，广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]