本发明专利技术公开了一种检测狂犬病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒及应用，该试剂盒含有：ａ）ＲＮＡ抽提液、ｂ）逆转录酶反应液、ｃ）逆转录酶、ｄ）ＲＮＡ酶抑制剂、ｅ）引物和ＴａｑＭａｎ探针、ｆ）标准阳性ＤＮＡ模板、ｇ）ＰＣＲ荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：５′－ＴＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＡＴＧＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡ－３′，反义引物：５′－ＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＡ－３′，扩增子大小为１２５ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入狂犬病毒Ｎ蛋白区３９１ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测Ａ↓［２６０］定量并１０倍梯度稀释。高效方便地对血清制品中的狂犬病毒的污染进行实时监控，还能为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR 试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的狂犬 病毒污染进行实时监控，同时为相关基础研究提供技术支持。
技术介绍
狂犬病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridae)，狂犬病毒属(Lyssavirus)，其核 酸为不分节段的单股负链RNA分子，狂犬病是由狂犬病毒引起的一种急性传染 病，人兽都可以感染，又称恐水病、疯狗病等。狂犬病毒主要在动物间传播，该 病主要是通过动物噬咬时牙齿上带的唾液中的狂犬病病毒侵入人或动物体而受 到感染。狂犬病一旦发病，其进展速度很快，多数在3-5天，很少有超过10天 的，病死率为100%。奶牛和肉牛群中，急性发作时，死亡率甚高，给畜牧业、 国际贸易出口和食品安全等带来严重的问题。由于Rabies的组织培养宿主范围 相当广，常导致培养细胞污染来自血清的Rabies，且常常不易引起注意，给细胞 培养以及相关基础研究带来一定的问题。狂犬病毒的快速检测是控制和消灭该病 的前提，但其常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技 术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类1. 血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、 沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术 等。在这些方法中得到普遍承认且广泛应用的有补体结合实验、间接血凝试验、 琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应 时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而 且重复性差。2. 生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不 敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高， 周期长，浪费生物资源和人力物力。3. 分子生物学诊断技术包括核酸杂交实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、负染电镜检测等。核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合 于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高， 不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法 特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸 片段。样品可以是器官、组织、细胞中的Rabies,并可与不同的Rabies株与轮 状病毒、边界病毒相区别，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法 测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终 产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算 出起始DNA或RNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定狂犬病毒是面临的主 要难题之一。近年来发展起来的荧光定量PCR (Fluorogenetic Quantitative PCR， FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM, Dalgaard M， et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology . Toxicology, 2001， 163:29-38 )、病原体的定性 (Bhudevi B, Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus . Vet. Microbiol. ， 2001, 83:1-10.)和 定量检领lj (Kathy F丄Tang, Jun Wang, Donald V丄ightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay . J. Virol. Methods, 115(2004) 109-114.; Birgit Liss. Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells . Nucleic Acids Res., 2002， Vol.30 No.17 e89.; Franck Housseau a， limberly R丄indsey a, et al. Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoring T lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients . J. Immunol. Methods 266(2002) 87-103.; Desire N, Dehee A, Schneider V， et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Pro viral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay . J. Clin. Microbiol, 2001, 39:1303-1310; Martell M, Gomez J, Esteban JI， et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA . J. Clin, Microbiol, 1999, 37:327-332; Kang B, Oh J, Lee C, Park BK, Park Y， Hong K, Lee K, Cho B， Song D. Evaluation of a rapid mmunodiagnostic test kit for rabies virus. J. Virol. Methods, 2007， 145(1): 30-36; Florence KP, Glaucia PB, Mireille S，4et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry . J. Virol. Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸 定量主要方法，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检 测的试剂盒上市。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测狂犬病毒的荧光定量PCR试剂盒，该 试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高、定量快速 准确、检测范围广、稳定性好。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染狂 犬病毒检测中的应用，可高效方便地对血清制品中的狂犬病毒污染进行实时监 控，同时为相关本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测狂犬病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，该试剂盒含有：ａ）ＲＮＡ抽提液、ｂ）逆转录酶反应液、ｃ）逆转录酶、ｄ）ＲＮＡ酶抑制剂、ｅ）引物和ＴａｑＭａｎ探针、ｆ）标准阳性ＤＮＡ模板、ｇ）荧光定量ＰＣＲ反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：５′－ＴＡＧＧＡＴＧＣＴＡＴＡＴＧＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡ－３′，反义引物：５′－ＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＡ－３′，扩增子大小为１２５ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡ－３′，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入狂犬病毒Ｎ蛋白区３９１ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测Ａ２６０定量并１０倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑从义，郭佳，徐国东，张国荣，
申请(专利权)人：武汉三利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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