本发明专利技术公开了一种检测牛细小病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒及应用，该试剂盒含有：ａ）ＤＮＡ提取试剂，ｂ）热启动Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ｃ）引物和ＴａｑＭａｎ探针，ｄ）标准阳性ＤＮＡ模板，ｅ）ＰＣＲ荧光定量反应液，其特征是：引物序列为正义引物：５′－ＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣ－３′，反义引物：５′－ＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＣＧＧＴＣＴＣＣＡＡ－３′，扩增子大小为１１８ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＡＣＡＡ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，靠近３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入细小病毒ＶＰ３蛋白编码区１１８ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测Ａ↓［２６０］定量并１０倍梯度稀释。荧光定量ＰＣＲ试剂盒在奶牛感染细小病毒流行病学调查中的应用，高效方便地对血清制品中的牛细小病毒污染进行实时监控，广泛适用于该病毒感染的流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，涉及一种检测牛细小病毒的荧光定量PCR试剂 盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的牛细小病 毒污染进行实时监控，同时广泛用于该病毒感染的流行病学调査，还可以为相关 基础研究提供技术支持。
技术介绍
牛细小病毒(Bovineparvovirus, BPV)属于细小病毒科细小病毒属，基因组 是单链的DNA分子，主要引起牛的呼吸道和肠道疾病，其主要特征是引发牛腹 泻另外致母牛流产。人工经口或静脉感染未吃初乳、体内不含抗体的新生牛犊， 于24 48小时出现腹泻，腹泻同时伴有病毒血症。且该病毒潜伏期不易被发觉， 其易感和潜伏性给畜牧业及其国际贸易带来严重的经济损失。因此，该病历来都 是国际社会最为关注的传染病之一。牛细小病毒的快速检测是控制和消灭该病的 前提，但细小病毒的常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学 诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类1. 血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、 沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光技术、放射免疫试验和免疫电镜技术等。在 这些方法中得到普遍承认、采用并且广泛应用的有补体结合实验、间接血凝实 验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应， 反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量， 而且重复性差。2. 生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不 敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高， 周期长，浪费生物资源和人力物力。3. 分子生物学诊断技术包括核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图 谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳3等检测方法更适用于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂， 过程繁多，成本高，不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下， 普通PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接 检测灭活的核酸片段。样品可以是牛血清，也可以是扁桃体、淋巴结、脊髓、肌 肉和皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都 是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板 量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。 因此，如何快速、准确测定牛腺病毒是面临的主要难题之一。近年来发展起来的荧光定量PCR (Fluorogenetic Quantitative PCR, FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM， Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology . Toxicology, 2001, 163:29-38 )、病原体的定性 (McGoldrick A, Lowings JP, Ibata G, et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) . J. Virol. Methods,1998, 72:125-135.; Bhudevi B, Wdnstock D. Fluorogenic RT陽PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus . Vet. Microbiol. , 2001, 83:1-10.)和定量检测(Kathy F丄Tang,Jun Wang, Donald V丄ightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay . J. Virol. Methods, 115(2004) 109國114.;Michaela Schwaiger, Pascal Cassinotti. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA . J. Clin. Microbiol., 27(2003) 136-145.;R.Frank Cookc, S丄Cooka， et al. Development of a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction for equine infectious anemia virus(EIAN) . J. Virol. Methods, 105(2002;) 171-179.; Birgit Liss* . Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells . Nucleic Acids Res" 2002,Vol.30 No.17 e89.;Franck Housseau 3,1 imberly R丄indsey a''， et al. Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoring T lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients . J. Immunol. Methods 266(2002) 87-103.; Desire N, Dehee A, Schneider V, et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 ProviralLoad by a TaqMan Real-Time PCR Assay . J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 1303國1310,; Martell M, Gomez J, Esteban JI, et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA . J. Clin. Microbiol, 1999， 37:327-332.; Kearns AM， Turne本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛细小病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，该试剂盒含有：ａ）ＤＮＡ提取试剂，ｂ）热启动Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ｃ）引物和ＴａｑＭａｎ探针，ｄ）标准阳性ＤＮＡ模板，ｅ）ＰＣＲ荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：５′－ＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣ－３′，反义引物：５′－ＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＣＧＧＴＣＴＣＣＡＡ－３′，扩增子大小为１１８ｂｐ，荧光探针序列为：５′－ＦＡＭ－ＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＡＣＡＡ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入细小病毒ＶＰ３蛋白编码区１１８ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测Ａ２６０定量并１０倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑从义，郭佳，李勇，黄璇，张国荣，
申请(专利权)人：武汉三利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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