本发明专利技术公开了一种荧光定量ＰＣＲ定性检测高危型ＨＰＶ的方法，该方法的荧光ＰＣＲ反应体系中镁离子的浓度为１～１０ｍＭ，Ｔａｑ聚合酶０．１～５Ｕ，各种引物及探针浓度为１００ｎＭ；在ＰＣＲ反应前测定反应前荧光值；在ＰＣＲ反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用公式ＶＬ＝２－（ＣｔＨＰＶ－ＣｔＨＭＢＳ）算出相对病毒载量值，并根据相对病毒载量值判定是否ＨＰＶ感染阳性。该方法可简单快速的对ＨＰＶ感染进行相对定量的检测。本发明专利技术还提供了一种用于该方法的试剂盒，使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测
，尤指一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法。
技术介绍
宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例约为45万， 死亡率为50%。Drs. Rous and Beard最早在1934曾经提出HPV为致癌物质，此后自1974 年Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的最可能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关 系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到 子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了 HPV，1983-1986年依 次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等型别。1995年IARC专题讨论会确定HPV感 染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99. 7%的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感 染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)属乳多空病毒科A亚群内的一组 DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm 55nm，基因组为共价闭合环状双 链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因 区，包括两个编码区和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包括E1、E2、E4、E5、 E6、E7;L区包括L1、L2，分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E蛋白主要负责病毒DNA的复 制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。当分离株病毒Ll区序列与已知序列近源病毒株同源性少于90%时，就可被确定 为一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高 危型 HPV 包括 HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 ；可能的高危型包 括 HPV26、53 和 66 ；低危型包括 HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81 和 CP6108。HPV 与 多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生 殖器癌及高度子宫颈上皮内瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖 道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要 价值。由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培养，也不能通 过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检验手段，因此，HPV的检测只能 依赖对其DNA序列的分子水平的检查。第二代杂交捕获法(hybrid caputure II，HC-II)是经美国FDA认证的可应用于 临床的HPV DNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检测13种高危型HPV病毒(包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、69)型，具体操作步骤样本DNA双链被释放并分 解为核苷酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将RNA-DNA杂 交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA-DNA杂交体结合，放大信号。碱 性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的判断标准是RLU (相对光单位，光信号)/Cutoff (域值=三个阳性质控 指标的平均值)》1为阳性，< 1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观性强，然而 缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。导流杂交技术是一种结合低密度基因芯片与导流杂交的新型检测技术(简称 HybriMax)，可进行 21 种 HPV 型别(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、 58、59、66、68、CP8304)的检测。导流杂交的技术原理为将探针固定于纤维膜上，使目标 分子在电流的引导下穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下 来。而非目标分子不能被结合固定而穿过薄膜被洗去。因此，导流杂交加速了互补分子之间 的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至十几分钟，比传统杂交法省时几百倍。而21种 型别探针共同固定于同一张膜条上，检测结果可以通过肉眼或专用软件获得，阳性点为清 晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV型别分布图，判断阳性点为何种型别，结果直观易判。 一台机器每次可检测15个标本，方便易行。因此，目前国内也有医院采用这一方法。虽然 有报道表明HybriMax检测诊断与HC-II对13种高危型HPV的检测结果总符合率可达90% 左右，但是实际应用中还有较多问题，如我们发现在使用HybriMax检测临床样本时 发现检测结果重复性较差即同一标本在不同检测人员的操作下、或者不同时间再次检测 时会出现不同结果。如我们曾经检测过凯普导流杂交实验检测HPV的重复率(对于49例 的临床样本DNA进行重复检测)，结果发现两次结果的符合例数仅为30例，即重复试验的符 合率为30/49X100%= 61%。这样的结果将不仅会对临床诊断造成影响，而且会影响临 床医生对于宫颈癌可疑患者的跟踪诊断，从而导致误诊或漏诊。我们通过大量的试验研究 发现其原因可能与下列因素有关1、杂交仪的使用与保养如杂交仪必须严格保养、隔离 条必须严格定时更换，如不及时更换可导致泄漏而造成结果的不准确；2、操作较复杂，需经 PCR及杂交两个阶段，一则因需时较长易产生误差，而则因PCR较容易受到污染而产生假阳 性；3、虽然能够分型，但是不能相对定量，只是定性和分型。然而HPV感染的定量非常重要 (如前述)。因此，这种方法也有待改进。用于HPV检测的主要方法所存在的缺陷，至今，尚未见对高危型HPV型别定量检测 的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中上述的问题，本专利技术提供一种本专利报道了一种即能够简单 快速的检测高危型HPV感染、又能够报告HPV感染相对定量的方法，以及用于该方法的试剂 盒，该方法可以从而大大提高高危型HPV感染的检出率。本专利技术的荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法包括如下步骤A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间 相距50 200个碱基；B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、 合成Taqman荧光探针；C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓 度为1 10mM，Taq聚合酶0. 1 5U，各种引物及探针浓度为10 500nM ；D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20 50次循环扩增反应，反应结束后测定反应 管中的荧光增值；E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表 荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相 对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量ＰＣＲ定性检测高危型ＨＰＶ的方法，该方法依次包括如下步骤： Ａ）根据待检测的ＨＰＶ基因的特异性核酸序列分别合成１３对引物，上下游引物之间相距５０～２００个碱基； Ｂ）并根据各型ＨＰＶ基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Ｔａｑｍａｎ荧光探针；、 Ｃ）使用步骤Ａ）中的引物和步骤Ｂ）中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为１～１０ｍＭ，Ｔａｑ聚合酶０．１～５Ｕ，各种引物及探针浓度为１０～５００ｎＭ； Ｄ）从待测临床标本中提取ＤＮＡ，取适量加入步骤Ｃ）中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量ＰＣＲ反应仪，进行２０～５０次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值； Ｅ）同时用系列阳性和阴性模板也进行Ｄ）的核酸提取反应，测得各自相应的代表荧光增值的循环数（Ｃｔ值），根据Ｃｔ值算出目的基因相对含量（算法详见后述），并将其相对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线； Ｆ）用上述步骤中获得的各样品Ｃｔ值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，李宁丽，顾关林，马式薇，陈勇，姜惠民，何昕，蔡佩民，管爱民，
申请(专利权)人：上海多纳美企业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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