本发明专利技术公开了一种检测牛副流行性感冒３型病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒及应用，该试剂盒含有：ａ）ＲＮＡ抽提液、ｂ）逆转录酶反应液、ｃ）逆转录酶、ｄ）ＲＮＡ酶抑制剂、ｅ）引物和ＴａｑＭａｎ探针、ｆ）标准阳性ＤＮＡ模板、ｇ）荧光定量ＰＣＲ反应液，其特征是引物序列分别为正义引物和反义引物：扩增子大小为１２９ｂｐ，荧光探针序列，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入牛副流行性感冒３型病毒保守的Ｆ蛋白编码区１８８ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测Ａ↓［２６０］定量并１０倍梯度稀释，结果更加准确、可靠、稳定、且重复性好。也可以进行牛流行性感冒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
-本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种检测牛副流行性感冒3型病毒的 荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，该荧光定量PCR 试剂盒可高效方便地对牛血液制品和牛血清进行定量检测和质量监控，也可以进 行牛副流行性感冒的流行病学调査，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
技术介绍
牛副流行性感冒3型病毒(Bovine parainfluenza virus type 3， PI-3)属副粘 病毒科(Paramyxoviridae)呼吸道病毒属(Respirovirus),是一种分段的负链RNA 病毒，病毒粒子的直径为120~180nm，核衣壳呈螺旋对称，含血凝素和神经氨酸 酶活性。血清学研究表明，健康牛血清中存在PI-3病毒抗体者较为普遍，因此 认为该病毒广泛分布于世界各地。动物因受到不良因素的影响或因有其他微生物 协同作用而发病一 自亚临床感染到致死性肺炎。该病毒也可使牛发生呼吸道疾病 以及肺炎等，曾从公牛精液和母牛生殖道中发现病毒，并可能导致不育。其发病 与潜伏给畜牧业、国际贸易出口和食品安全等带来严重的问题。牛副流行性感冒 3型病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但其常规检测方法有一些不足之 处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三 类1. 血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、 沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术 等。在这些方法中得到普遍承认且广泛应用的有补体结合实验、间接血凝试验、 琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应 时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而 且重复性差。2. 生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不 敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶 链式反应、负染电镜检测等。核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合 于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高， 不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法 特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸 片段。样品可以是器官、组织、细胞中的PI-3，并可与不同的流感株相区别，这 是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物， 而不是起始DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有 线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA或RNA拷贝数。 因此，如何快速、准确测定牛副流行性感冒3型病毒是面临的主要难题之一。近年来发展起来的荧光定量PCR (Fluorogenetic Quantitative PCR， FQ-PCR) 技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM, Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology. Toxicology, 2001, 163:29-38 )、病原体的定性 (Bhudevi B, Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus . Vet. Microbiol., 2001, 83:1-10.)和 定量检观!l (Kathy F丄Tang, Jun ^Vang, Donald V.Lightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay . J. Virol. Methods, 115(2004) 109-114.; Birgit Liss*. Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells . Nucleic Acids Res.， 2002, Vol.30 No. 17 e89.; Franck Housseau a, limberiy R丄indsey a, et al. Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoring T lymphocyte reactivity to fUll-length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients . J. Immunol. Methods 266(2002) 87-103.;Desire N, Dehee A, Schneider V, et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay . J. Clin. Microbiol, 2001, 39:1303-1310.; Martell M， Gomez J, Esteban JI, et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA . J. Clin. Microbiol, 1999, 37:327-332.; Cordey, S.， Thomas, Y" Cherpillod, P.， van Belle, S., Tapparel, C., Kaiser, L. Simultaneous detection of parainfluenza viruses 1 and 3 byreal-time reverse transcription-polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 2009, 156:166-168.; Florence KP, Glaucia PB， Mireille S, et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry . J. Virol. Methods, 2001， 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前也已有关 于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测牛副流行性感冒3型病毒的荧光定量 PCR试剂盒，该试剂盒适本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛副流行性感冒３型病毒的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，该试剂盒含有：ａ）ＲＮＡ抽提液、ｂ）逆转录酶反应液、ｃ）逆转录酶、ｄ）ＲＮＡ酶抑制剂、ｅ）引物和ＴａｑＭａｎ探针、ｆ）标准阳性ＤＮＡ模板、ｇ）荧光定量ＰＣＲ反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：５’－ＴＴＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧ－３’，反义引物：５’－ＣＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣ－３’，扩增子大小为１２９ｂｐ，荧光探针序列为：５′ＦＡＭ－ＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧ－ＴＣＧＣ－ＴＡＭＲＡ－３′，探针的５’端标记荧光发射基团ＦＡＭ，３’端标记荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，标准阳性ＤＮＡ模板由已插入牛副流行性感冒３型病毒保守的Ｆ蛋白编码区１８８ｂｐ片段的ｐＧＥＭ－Ｔ载体转化大肠杆菌ＤＨ５α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测Ａ↓［２６０］定量并１０倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑从义，郭佳，黄璇，张国荣，
申请(专利权)人：武汉三利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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