人博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒，特别是涉及利用实时荧光ＰＣＲ技术检测人博卡病毒的试剂盒。本试剂盒操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可对多种类型标本中人博卡病毒进行定性或定量检测，用于早期诊断、流行病学研究等多个领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测人博 卡病毒的试剂盒。
技术介绍
冬季小儿呼吸道感染高发，其病原很复杂，除细菌、支原体、衣原体之外，很大一部分 为病毒。近20年来，新发现的30多种传染病的病原中， 一半以上是病毒，特别是婴幼儿急 性呼吸道感染的病原中，绝大部分为病毒。尽管如此，还有相当一部分婴幼儿急性呼吸道感 染的病原尚不清楚。在我国，小儿下呼吸道感染是住院治疗的首要原因，而小儿肺炎是引起 小儿死亡第5位的主要原因。美国每年约有250，000儿童因下呼吸道感染住院。在临床上， 有约12-39%的小儿下呼吸道感染病因不明。2005年8月，瑞典斯德哥尔摩市卡罗林斯卡大学 医院的科学家运用分子病毒筛査方法，首次在儿童呼吸道分泌物中发现了这种"非常普遍、 以前未知"的病原体，其基因序列与细小病毒科的牛(bovine)、犬(canine)细小病毒相近，他 们将这种病毒命名为人类博卡病毒(human bocavirus， HBoV) (Tobias Allander， Martti T. Ta咖i ， Margareta Eriksson, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. PNAS. Sept. 2005， vol 102, p. 12891-128%)。 进一步的研究发现，该病毒与儿童急性下呼吸道感染有关。 一个月后，澳大利亚学者再次从 急性呼吸道感染的儿童中，检获同一种病毒(Sloots TP，McErlean DJ.Speicher KE. Arden MD. Nissen， and IM. Mackay. 2006. Evidence of human coronavirus HKU1 and human bocavirus in Australian children. J. Clin. Virol. 35:99-102.)。此后，荷兰、加拿大、美国、法国、 澳大利亚以及亚洲的中国、日本、韩国、泰国也相继报道了这种病毒的感染情况。HBoV在呼吸道感染的患者样本中频繁被检测到。但它在呼吸道感染中所扮演的角色还 不清楚。苏格兰爱丁堡大学的Peter Simmonds博士在924例呼吸道感染者(主要来自婴幼儿 患者)中进行了HBoV筛查，研究发现朋oV感染频率仅次于呼吸道合胞病毒和腺病毒，列 第三位，且感染者几乎全部是婴幼儿。耶鲁大学医学院的Jeffrey S. Kahn博士通过将无呼 吸道感染症状的个体作为对照组，在儿童中进行朋oV筛査，发现在对照组个体中没有或极少 发现HBov，因此认为HBoV是导致婴幼儿上、下呼吸道疾病的病原体之一。尽管在这两次研 究中所涉及的人群范围较小，采用样本的婴儿都在同一年龄，样本都是在同一家医院的不同 时间抽取的，但它揭示了病毒和疾病之间统计学上的关联。在临床上，朋oV不易区别于其他呼吸道病毒，正引起许多学者、专家的密切关注，其致病性、发病机制、传播途径、感染人群、机体的免疫反应等，尚需进行更多研究。对HBoV感染的检测意义体现在以下几个方面(1)通过检测有(或无)呼吸道感染症状 个体的HBoV感染情况，阐明呼吸道感染与HBoV联系，了解临床病征相关性。(2)简单易行 的HBoV检测方法，便于在人群中进行大规模的HBoV筛査或流行病学调査，帮助我们了解这 种新病毒朋oV在其他人群中的感染、传播和季节分布情况。(3)为了解这种病毒的致病性和 发病机制提供了条件，对进一步研究防治措施和研制预防疫苗将起到积极作用。目前朋oV诊断主要为血清学检査和分子生物学方法。如通过在昆虫细胞中表达特异性的病毒抗原蛋白，建立人博卡病毒特异性抗体血清酶联免疫检测技术。该技术适合于人博卡病 毒感染的血清学诊断及大规模的血清流行病学调査。但是受方法本身灵敏度限制，对于病毒 含量较低的患者可能会出现检测的假阴性，自身免疫性疾病患者也可能出现假阳性。此外， 血清化验检测到的抗体只能代表现在或者过去有感染，而不能区别急性感染和慢性感染以及 治愈者，所以不适于作为急性感染的标志。分子生物学方法主要是根据保守区设计引物，再通过电泳对PCR扩增产物进行鉴定。荧 光定量PCR (FQ-PCR)用于病原学诊断，是PCR
的一项创新，FQ-PCR直接检测HBoV 核酸，特异性强、敏感性很高，是目前诊断HBoV感染的主要方法。与血清学检测方法相比具 有以下的优势(1)具有更高的灵敏性，适用于鼻咽分泌物的检测。(2)针对病毒特异性序 列设计引物探针，与血清学检验所用的抗原片段相比，具有更高的特异性，避免了常规血清 学检测中与呼吸道病毒的交叉反应；(3)对病毒进行定量检测，可真实反映出患者体内病原 体拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病预后，选择治疗方案及监测治疗效果等。(4) 可扩大检测人群范围，进行流行病学调査和病原体筛查；(5)将PCR的敏感性与探针杂交的 特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；(6)闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；(7) 实时检测技术可连续不断地检测PCR过程中荧光信号的变化，避免了传统PCR的"平台期效 应"，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值计算出，准确性和灵敏度均有提高。本专利技术选取人博卡病毒(朋oV)基因组中保守序列作为扩增靶序列区域，设计特异性引 物和荧光探针，通过实时荧光PCR对HBoV进行实时荧光PCR检测，该方法相比其它方法有以 下几点优点(1)操作简单，耗时少，成本低，不需要电泳检测产物，从仪器上读出数据对 检测样本定量；(2)可一次检测大量样本，敏感性高于血清学检测方法，可获得病毒载量， 从而用于了解病毒载量与临床症状的关系。临床研究结果表明检测人博卡病毒(HBoV)为 小儿下呼吸道感染的临床病因快速诊断、治疗提供新的依据，对于确认其在中国的流行分布 和进一步了解这种新病毒将起积极作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种利用实时荧光PCR技术定性或定量检测人博卡病毒的试剂 盒，该试剂盒包括(l)DNA提取试剂、核酸扩增反应体系、纯水、定量参考品、阴性质控品、 阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。本专利技术的目的是这样实现的(1)针对人博卡病毒保守序列设计的能够与靶多核苷酸结 合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针；(2)将寡核苷酸探针标记上荧光发生基团，使所说的荧 光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合，(3)选择适宜于PCR扩增的反应体系和荧光检 测体系；(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，分析循环扩增后产生的荧光量以确定耙多 核苷酸的存在及定量。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所述的核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、 2'-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向寡核苷酸引物、能够 与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向寡核苷酸引物、能够与耙多聚核苷酸结合并且两 末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用实时荧光ＰＣＲ技术定性或定量检测人博卡病毒的试剂盒，该试剂盒包括：（１）ＤＮＡ提取试剂、核酸扩增反应体系、纯水、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品，和（２）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中核酸扩增反应体系包括耐热ＤＮＡ聚合酶、２’－脱氧核苷三磷酸、正向寡核苷酸引物、反向寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液，其特征在于扩增反应所使用的正向和反向寡核苷酸引物的序列分别为５’－ＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧ－３’和５’－ＧＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王方金，何瑰，乔颖飒，李明，朱振宇，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]