本发明专利技术公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法。多重PCR方法引物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对。该方法利用不同引物对扩增出不同大小的病毒核酸片段来达到鉴别诊断的目的。本发明专利技术可同时检测并区分PBoV1、PBoV2和PBoV3，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利属于动物病原微生物检测
，具体的说是一种同时鉴别三种不同猪博卡病毒的多重PCR检测方法。
技术介绍
猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)自2009年被首次发现以来，证实存在序列同源性较低的三种基因型(Jiang YH et al，2014，J Gen Virol，95：453-465)，被疑为猪圆环病毒相关性疾病、“猪腹泻病”的重要病原，并在这类病的发生发展上起重要作用，已成为世界各国科研人员的研究热点。猪博卡病毒1型(PBoV1)发现于瑞典患仔猪多系统衰竭综合征的猪体中，其基因组大小约为4786bp(GenBank Number：HQ223038)，核苷酸序列水平上与犬博卡病毒、牛细小病毒、大猩猩博卡病毒和人博卡病毒的同源性分别为52-55％、44-45％、50％和44-48％(AL et al.，2009，Virus Res，146(1-2)：125-129)。基因组结构编码3个主要的开放阅读框(Open reading frames，ORF)，ORF1和ORF3编码非结构蛋白(NS1和NP1)，ORF2编码结构蛋白(VP1/2)(Zeng S et al.，2011，J Gen Virol，92(Pt 4)：784-788)。猪博卡病毒2型(PBoV2)亦是利用病毒的宏基因组研究方法之一非序列依赖的单一引物核酸扩增技术(Sequence-independent single primer amplification，SISPA)由中国科研人员发现于中国健康猪群的粪便中，而在该基因型中仍有不同的基因亚群，它们的基因组大小分别约为5173bp和5186bp(GenBank Number：HM053693-GU053694)，核苷酸序列同源性为 93.6％-94.2％。与其他博卡病毒属一样也有3个主要的ORF(Cheng WX，et al.，2010，PLoS One，5(10)：e13583)。此外，在发现PBoV2的同时，在样品6V和7V中还发现了不同于PBoV2的DNA片段(2407bp和2434bp)(GenBank Number：HM053672-HM053673)，其包括部分非结构蛋白基因和完整的VP1基因，故把6V和7V命名为猪博卡病毒3型(PBoV3)。之后的研究中，北爱尔兰研究人员又报道两种PBoV，其基因组大小为5082bp(GenBank Number：JF512472)和4125bp(GenBank Number：JF512473)，进化树分析其也与6V和7V同源性高(McKillen J et al.，2011，Vet Microbiol，152(1-2)：39-45)。香港的科学人员也发现两种PBoV，其基因组大小为5278bp和5177bp(GenBank Number：JF429834-JF429836)，进化树分析其与6V和7V同源性高(Lau SK et al.，2011，J Gen Virol，92(Pt 9)：2047-2059)。目前，猪场中猪博卡病毒混合感染严重。现有文献表明，由于病原研究基础较薄弱和体外病毒分离培养等难度，其检测方法主要有单纯PCR(Zhai S et al.，2010，Arch Virol，155(8)：1313-1317)、荧光PCR(Li B et al.，J Virol Methods.179(2)：390-395)、双重PCR(蔡雨函等，2013，中国兽医科学，43(8)：833-838)等，存在着费时费力、不能同时鉴别三种病毒等缺点。
技术实现思路
本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，构建三种猪博卡病毒多重PCR检测方法，实现猪博卡病毒“一样三检”的快速检测效果。该方法为猪博卡病毒诊断提供一种快速检测方法，填补三种猪博卡病毒诊断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的 诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。本专利技术专利要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：本专利技术涉及的检测引物有3对，分别是PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中用于PBoV1检测的PBoV1引物对包括PBoV1-F和PBoV1-R两条引物，用于PBoV2检测的PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及用于PBoV3检测的PBoV3引物对包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物。本专利技术的特征还涉及到以下步骤。配置50μL PCR反应体系：2×Buffer 25μL，PBoV1-F、PBoV1-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F和PBoV3-R各0.5μL，PBoV1、PBoV2及PBoV3模板分别3μL，灭菌H2O 13μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；结果观察：取10μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。进一步的，本专利技术建立的方法，其特征在于包括了本专利技术所述的引物。更进一步的，本专利技术所述的引物用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型。所述的步骤用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型的单一感染或混合感染。本专利技术所述的应用或者检测方法不仅仅用于临床的疾病诊断和检测，还可以应用于畜牧业、食品安全、生物制药、生物模型构建等多种非疾病诊断和治疗的领域。本专利技术公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。该方法为猪博卡病毒的诊断提供 一种快速检测方法，填补三种猪博卡病毒诊断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。附图说明图1是多重PCR扩增结果；M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：PBoV1阳性质粒；3：PBoV2阳性质粒；4：PBoV3阳性质粒；5：PBoV1+PBoV2+PBoV3阳性质粒；图2是多重PCR特异性试验结果；M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：PBoV1阳性质粒；3：PBoV2阳性质粒；4：PBoV3阳性质粒；5：PBoV1+PBoV2+PBoV3阳性质粒；6：猪圆环病毒2型阳性DNA；7：犬博卡病毒阳性DNA；8：猫博卡病毒阳性DNA；图3多重PCR敏感性结果；M：DNA Marker 2000；1-8：100-10-7质粒倍比稀释。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。优化实施例： 1材料和方法 1.1猪博卡病毒1型、2型和3型阳性重组质粒，猪圆环病毒2型毒株由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，猪博卡病毒3型、犬博卡病毒、猫博卡病毒毒株由香港大学刘嘉佩教授馈赠。1.2主要试剂DNA提取试剂盒、PCR试剂购自北京天根公司，DNA Marke本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中PBoV1引物对包括PBoV1‑F和PBoV1‑R两条引物，PBoV2引物对包括PBoV2‑F和PBoV2‑R两条引物以及PBoV3引物对包括PBoV3‑F和PBoV3‑R两条引物。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中PBoV1引物对包括PBoV1-F和PBoV1-R两条引物，PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及PBoV3引物对包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物。
2.如权利要求1所述的引物组合物，所述的引物具体为：
PBoV1-F：TCAATGGTACGTGCCGATAT SEQ ID NO.1
PBoV1-R：TTATTCTGCTTCGCCTGGTT SEQ ID NO.2
PBoV2-F：GAGGTATTCAGCCAGCACAT SEQ ID NO.3
PBoV2-R：AGYTCCTGCGGTTCTGTTTC SEQ ID NO.4
PBoV3-F：TYTTGAACATCCAGGGCTAC SEQ ID NO.5
PBoV3-R：CCATACACCTTBACCGCVTK SEQ ID NO.6。
3.如权利要求1或2所述的引物组合物的应用，所述应用为猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测。
4.如权利要求3的应用，所述应用具体为包括以下步骤：配置50μLPCR反应体系：2×Buffer 25μL，PBoV1-F、PBoV1-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F和PBoV3-R各0.5μL，PBoV1、PBoV2及PB...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟少伦，李小鹏，魏文康，陈琴苓，吕殿红，吴大成，温肖会，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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