本发明专利技术所涉及的一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量ＰＣＲ快速诊断试剂盒及其应用方法，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对ＣＳＦＶ野毒的快速定量检测，可排除ＣＳＦＶ兔化弱毒（ＨＣＬＶ）疫苗免疫带来的假阳性。本发明专利技术与现有技术相比具有以下优点：能够对猪瘟病毒野毒感染和疫苗免疫进行鉴别诊断，解决了临床样本检测中不能排除免疫疫苗带了的假阳性问题；特异性好，通过引物高特异扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，具有很高的准确性，假阳性低；灵敏度高；检测速度快，仅１个小时，加上核酸的提取和ｃＤＮＡ的制备，共需２－３个小时；没有后处理，不用杂交、电泳、拍照等过程，不产生污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术所涉及的一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应 用方法，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对CSFV野毒的快速定量检测，可排除 CSFV兔化弱毒(HCLV)疫苗免疫带来的假阳性。技术背景猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV) 引起的猪的急性、接触性传染病，死亡率高达90%以上。猪瘟在全世界范围内发生和流行， 给养猪业造成严重的危害和巨大经济损失，被国际动物卫生组织(OIE)列为必须申报的法定 传染病之一。我国也是猪瘟的高发国之一，近年来我国猪瘟的流行特点以散发流行、慢性猪 瘟、持续感染和亚临床感染为主，使猪瘟的防治更加困难，危害日趋严重。我国政府一直都 对猪瘟的防制高度重视，并相继提出了一系列的防制措施，要求对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗(Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV)免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，更增加 了猪瘟的监测难度，容易产生假阳性。现有的诊断方法如病毒分离培养(Virus Isoloation, VI )、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked I鹏画Sorbent Assay, EIJSA)、反转录一聚合酶链扩增法(Reverse Transcript- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、免疫荧光技术(I誦unoFluorescence Assay, IFA)等均不能区别猪CSFV野毒感染和疫苗免疫。因此，建立一种能区别猪瘟病毒野 毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断方法是一个亟待解决的问题。猪瘟病毒的基因组为单股、正链、不分节段的RNA分子。核苷酸同源性分析表明猪瘟 病毒野毒和HCLV疫苗都有各自特有的核苷酸序列。通过设计猪瘟病毒野毒特异性的杂交探 针，同时结合灵敏的检测技术，就可以对猪瘟病毒野毒特有的核苷酸序列进行检测，从而实 现对猪瘟病毒野毒和疫苗的鉴别诊断。20世纪90年代中期发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR， FQ-PCR)方法就可以对这类杂交探针进行高效检测。 该技术是在普通PCR的基础上增加了一条具有高特异性的荧光标记DNA探针，通过始点定量 和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现对核酸进行定量检测的。该技术具有灵敏度高、 耗时短、特异性强、可定量检测等优点。依据FQ-PCR技术，在国内外无论人医应用方面，还 是兽医应用方面，都已经研制出了多种荧光定量PCR快速诊断试剂盒。现有技术关于猪瘟病毒抗原、抗体检测及荧光定量PCR技术的文献，主要有以下几项，如专利号申请号为200710176125X的文献"检测猪瘟病毒特异抗体的方法及其酶联免疫试剂 盒"公开了一种检测猪瘟病毒抗原制备和抗体检测方法，但未涉及猪瘟病毒抗原的检测；专 利号为200610109404的文献"猪瘟病毒荧光RT-PCR诊断试剂盒"，专利申请号为02109350.4 的"一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒及应用"公开了 两种猪瘟病毒抗原的检测方法，但未涉及猪瘟病毒野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断技术。
技术实现思路
本专利技术的另一目的在于提供一种利用荧光定量PCR技术制备了一种特异检测猪瘟病毒野 毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒能够特异灵敏地检测出猪瘟病毒野毒抗原， 而免疫的HCLV疫苗抗原检测不出，从而实现猪瘟病毒野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断。本专利技术的目的在于提供一种精确简便的用于定量检测猪瘟病毒野毒抗原的方法。本专利技术为解决上述技术问题采用的技术方案是 一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光 定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括a) RNA裂解液、b)反转录反应液、c) 荧光定量反应液、d)猪瘟病毒野毒强阳性和临界阳性质控品、e)阴性质控品和f)定量标 准品，反转录反应液含有引物RCSFV，其序列为5'- TGCCCACAGTAGGACTAGCAAAC -3' 23nt; 荧光定量反应液含有上游引物FCSFV和下游引物RCSFV以及荧光探针PCSFV，上游引物FCSFV 序列为5'- TGCCCACAGTAGGACTAGCAAAC -3' 23nt ;下游引物RCSFV序列为5'-CAGGACTTAGACCACCCAGGG -3' 21nt;荧光探针PCSFV序列为5'- TCGCCACTACGGCTAG -3' 16nt，荧光探针PCSFV 5'端标记的是荧光报告基团FAM， 3'端标记的是非荧光淬灭基团，3' 端另标记了 MGB(minor groove binder)结合物。按上述方案，所述的反转录反应液由lxRT Buffer, dNTPs 0. 5mM， M-MLV酶50U和引物 RCSFV 0. 4pM组成。按上述方案，荧光定量反应液由lxPCR Buffer, MgCl2德,dNTPs 0. 5函,Taq酶2U,引 物FCSFV和RCSFV各0. 2pM和荧光探针PCSFV 0. 2一组成。按上述方案，所述的猪瘟病毒野毒强阳性为高滴度的猪瘟病毒石门株(一般为106 107TCID5。/ml)，其在PK15细胞上传代增殖，经过灭活后得到；临界阳性质控品为猪瘟病毒野 毒强阳性经103稀释后制得。按上述方案，所述的阴性质控品是采集健康的且无病原的猪各组织，按体积比l: 5加入 PBS液，充分匀浆破碎，离心去除沉淀，上清保存备用。按上述方案，所述定量标准品是合成的长链引物，其序列为CAGGACTTAGACCACCCAGGGAGC一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在 于包括有以下步骤1) 猪瘟病毒基因组RNA的提取分别向200^1待检测标本、d)猪瘟病毒野毒强阳性和 临界阳性质控品中加入lmlRNA裂解液，静置5min后，加入200^1氯仿，高速离心后吸取 上清，上清中加入等体积的异丙醇，再进行冰浴并高速离心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗涤 后，用20pl灭菌水溶解，所得溶液即为RNA模板；2) 反转录反应分别向步骤l)制备的RNA模板18nl中加入反转录反应液7W，在42'C 下温浴反应30min，再水浴加温到95'C反应5min，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA 模板；3) 分别取步骤2)得到cDNA模板和同样量的系列稀释的定量标准品加入到荧光定量反 应液中，用荧光定量检测仪进行PCR反应并实时检测反应过程中释放的荧光强度，PCR反应 得到猪瘟病毒特异性扩增目的基因，所述的猪瘟病毒特异性扩增目的基因序列为TGCCCACA GTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTG;4) 通过比较待检测标本和标准品的循环域值对待检标本的起始拷贝数进行定量。 本专利技术的主要技术原理在于荧光定量PCR (FQ-PCR)技术包括探针法和染料法两种。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以T叫man探针法为代表，常 用的荧光报告基团是FAM、 VIC、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量ＰＣＲ快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：ａ）ＲＮＡ裂解液、ｂ）反转录反应液、ｃ）荧光定量反应液、ｄ）猪瘟病毒野毒强阳性和临界阳性质控品、ｅ）阴性质控品和ｆ）定量标准品，反转录反应液含有引物ＲＣＳＦＶ，其序列为５′－ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣＡＡＡＣ－３′２３ｎｔ；荧光定量反应液含有上游引物ＦＣＳＦＶ和下游引物ＲＣＳＦＶ以及荧光探针ＰＣＳＦＶ，上游引物ＦＣＳＦＶ序列为：５′－ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣＡＡＡＣ－３′２３ｎｔ；下游引物ＲＣＳＦＶ序列为：５′－ＣＡＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧ－３′２１ｎｔ；荧光探针ＰＣＳＦＶ序列为５′－ＴＣＧＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＧ－３′１６ｎｔ，荧光探针ＰＣＳＦＶ ５′端标记的是荧光报告基团ＦＡＭ，３′端标记的是非荧光淬灭基团，３′端另标记了ＭＧＢ结合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温国元，邵华斌，杨峻，罗青平，张蓉蓉，艾地云，王红琳，罗玲，李坤，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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