一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法技术

本发明专利技术提供一种荧光标记探针的ＰＣＲ－ＬＤＲ基因多态性检测测序方法。本发明专利技术利用荧光标记探针进行ＰＣＲ关联ＬＤＲ和测序技术来进行基因多态性位点检测。本发明专利技术方法包括以下步骤：引物和探针设计、ＰＣＲ检测、ＬＤＲ检测、测序仪结果检测。本发明专利技术的方法由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性；测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测；位点的高通量，利用测序仪的５　色荧光检测系统，同时能利用４种荧光，使测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种荧光标记探针的ＰＣＲ－ＬＤＲ基因多态性检测测序方法，其特征在于该方法包括以下步骤：　（一）探针设计　（１）针对检测的位点，设计一系列ＬＤＲ产物的分子量系列；　（２）设计一个专有荧光标记探针，该探针具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；　（３）设计一个专有模板，该模板具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；　（４）在标记探针的３’端和检测探针的５’端引入随机序列来调整探针长度；　（二）ＰＣＲ检测　取待检测ＤＮＡ　１μｌ，ＰＣＲ引物各１０－３０ｐｍｏｌ，高温聚合酶，高温聚合酶混合液，相互混合，ＰＣＲ反应条件为：９４℃３０秒，４０－６８℃３０秒－２分钟，６０－７２℃４５秒－２分钟，循环２５－４０次；　（三）ＬＤＲ检测　取ＰＣＲ产物１μｌ，探针各４０ｆｍｏｌ－１０ｐｍｏｌ，连接酶，连接酶缓冲液，相互混合，ＬＤＲ反应条件为：９４℃　３０秒，４０－７０℃（优选４５－６０℃）１－１０分钟，循环１－４０次；　（四）结果检测　取ＬＤＲ产物１－５μｌ，混合测序系统的ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，测序仪上样，进行ＬＤＲ产物分离鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖君华，陆炯，陈轶群，
申请(专利权)人：上海翼和应用生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]