重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用，涉及生物工程的技术领域，包括采用荧光定量PCR的方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的GAPDH、AOX1和目的基因的Ct值，通过比较GAPDH、AOX1和目的基因的Ct值的大小关系可快速筛选获得Mut

【技术实现步骤摘要】
重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]毕赤酵母(Pichia pastoris)是近十年发展起来的真核表达体系，是目前较为成功的外源蛋白表达系统之一。与现有的其它表达系统相比，酵母具有表达菌株遗传性质稳定、表达量高、生物活性好、培养密度高、生产成本低、产物易于纯化、安全性风险低等优点，该系统已成功表达了多个病毒样颗粒疫苗，如乙肝疫苗、戊肝疫苗、HPV疫苗等均获得了较好的应用。
[0003]相比于其他酵母表达系统毕赤酵母具有以下特殊的优点：(1)具有醇氧化酶AOX基因启动子，AOX是目前调控机理最严格的启动子之一；(2)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(3)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高；(4)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解。
[0004]毕赤酵母天然无游离质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达质粒为穿梭质粒，先在大肠杆菌中复制扩增后导入宿主酵母细胞中。为使产物分泌至胞外，表达载体还需带有信号肽序列。胞内表达载体可以将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含
‑
S
‑
S
‑
的非糖基化蛋白以及组装类蛋白(VLP)，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。
[0005]在毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有两种基因编码，即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为Mut
s
。存在AOX1时，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为Mut
+
。毕赤酵母的最适生长温度为28～30℃，诱导期间超过32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。Mut
s
和Mut
+
菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1启动子被强烈诱导，Mut
+
较Mut
s
生长更快(4～5倍)。
[0006]在转化外源基因时，质粒载体上的pAOX位点(AOX启动子)或pAOX转录终止子TT或下游3
’
AOX1三个位点与酵母宿主菌基因发生同源重组。在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的AOX1，此重组转化子的表现型不变，仍为Mut
+
，反之为Mut
s
。在某些情况下，转化质粒/载体基因会多次插入至基因组中，形成多拷贝的串联表达盒，不过此类多拷贝自然发生概率较低，需要通过高通量等手段来加大筛选通量来提高筛选概率。
[0007]常规的转化子筛选方法是观察转化子在培养皿上的生长情况判断Mut
+
和Mut
s
，并通过小体积诱导培养后检测目的蛋白的表达情况(Western Blot或ELISA)确定表达株。此
方法操作步骤繁多，时间周期较长，不适宜作为高通量筛选的手段。因此简化筛选Mut
+
和Mut
s
的操作步骤，缩短筛选时间，提高筛选通量是目前有待解决的问题。
[0008]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的第一目的在于提供一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，该方法缓解了现有技术中重组毕赤酵母高产表达株筛选操作复杂，通量低的技术问题。
[0010]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法在制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中的应用。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0012]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，包括：
[0013](a)采用荧光定量PCR方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因、醇氧化酶基因AOX1和目的基因的扩增循环数Ct，分别记为Ct
(GAPDH)
、Ct
(Target)
和Ct
(AOX1)
；
[0014](b)按照如下方获取X值；
[0015](b1)Ct
(Target)
≥Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≤Ct
(GAPDH)
的转化子判定为基因插入位置失败的转化子；
[0016](b2)Ct
(Target)
≤Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
＞Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
S
表现型；
[0017](b3)Ct
(Target)
＜Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≤Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
+
表现型A类，计算X值，X＝Ct
(AOX1)
‑
Ct
(Target)
；
[0018](b4)Ct
(Target)
＞Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≥Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
+
表现型B类，计算X值，X＝Ct
(AOX1)
‑
Ct
(Target)
；
[0019](c)按降序排列各转化子的X值：
[0020]若存在Mut
+
表现型A类的转化子，仅比较判定为Mut
+
表现型A类的转化子的X值，取X值最大的转化子为重组毕赤酵母高产表达株；
[0021]若不存在Mut
+
表现型A类的转化子，仅比较判定为Mut
+
表现型B类的转化子的X值，取X值最大的转化子为重组毕赤酵母高产表达株。
[0022]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法在制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0024]本专利技术提供的重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法通过采用荧光定量PCR的方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的甘油醛
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，其特征在于，包括：(a)采用荧光定量PCR方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因、醇氧化酶基因AOX1和目的基因的扩增循环数Ct，分别记为Ct
(GAPDH)
、Ct
(Target)
和Ct
(AOX1)
；(b)按照如下方获取X值；(b1)Ct
(Target)
≥Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≤Ct
(GAPDH)
的转化子判定为基因插入位置失败的转化子；(b2)Ct
(Target)
≤Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
＞Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
S
表现型；(b3)Ct
(Target)
＜Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≤Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
+
表现型A类，计算X值，X＝Ct
(AOX1)
‑
Ct
(Target)
；(b4)Ct
(Target)
＞Ct
(GAPDH)
同时Ct
(AOX1)
≥Ct
(GAPDH)
的转化子判定为Mut
+
表现型B类，计算X值，X＝Ct
(AOX1)
‑
Ct
(Target)
；(c)按降序排列各转化子的X值：若存在Mut
+
表现型A类的转化子，仅比较判定为Mut
+
表现型A类的转化子的X值，取X值最大的转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建城，陈晓雨，易晓男，曹玉锋，史力，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：