硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法及其应用技术

本发明专利技术涉及硫代寡聚核苷酸纯化技术领域，尤其是涉及硫代寡聚核苷酸聚合物的液相色谱分离方法及其应用。本发明专利技术提供的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法操作简便且成本低廉，经过验证，其检测结果中目标峰保留时间误差＜1min，峰面积RE＜10％，纯度RE＜3％满足硫代寡聚核苷酸纯化需求，且稳定性好，重复性高，适宜实际生产推广应用。实际生产推广应用。实际生产推广应用。

【技术实现步骤摘要】
硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法及其应用


[0001]本专利技术涉及硫代寡聚核苷酸聚合物纯化
，尤其是涉及硫代寡聚核苷酸聚合物的液相色谱分离方法及其应用。

技术介绍

[0002]寡聚核苷酸片段样品(如CPG
‑
ODN)是含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)。采用化学合成方法获得的CPG
‑
ODN是经硫代修饰的单链脱氧寡核苷酸高分子聚合物，该聚合物随产物本身链长的增加，疏水性差异会逐渐减小，这使得采用常规的高效液相色谱对其进行分离分析变得极为困难，在现有技术中，已见报道的CPG
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ODN的纯度的检测方法包括，(1)采用比色法检测CPG
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ODN的纯度，如王学菊，刘璟等提出的“MTT比色法建立B型CPG
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ODN活性检测标准，《细胞与分子免疫学杂质》2008年01期，69～71页”。(2)采用ELISA法检测CPG
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ODN的纯度，如专利CN100526876C提供了一种检测人未甲基化寡聚脱氧核苷酸ELISA检测试剂盒，对CPG
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ODN进行修饰和水解，而后结合反相
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高效液相色谱对水解样品进行检测，从而确定CPG
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ODN纯度。(3)毛细管电泳法检测CPG
‑
ODN的纯度。
[0003]上述方法均存在稳定性差和重复性低的缺点，同时毛细管电泳法使用的主要检测设备之一毛细管电泳仪价格昂贵，普及率低，难以推广应用到实际生产中。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法并将该方法应用于硫代寡聚核苷酸的纯化中，以缓解了现有技术中存在的稳定性差和重复度低的技术问题，适宜推广应用。
[0006]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
[0008]以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，流动相A和流动相B的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
[0009]流动相梯度设置包括以下(a)～(c)中任一种：
[0010](a)流动相B初始比例为0％，且流动相B比例由0％升至100％的洗脱阶段至少为两个；
[0011](b)流动相B初始比例为20％，流动相B比例由20％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相B比例由20％升至100％的时间为20～30min；
[0012](c)流动相B初始比例为50％，流动相B比例由50％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相B比例由50％升至100％的时间为29～31min。
[0013]在可选的实施方式中，所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为19～21mM，所
述流动相B中NaCl的浓度为3.9～4.1M。
[0014]在可选的实施方式中，所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M。
[0015]在可选的实施方式中，流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度：50℃。
[0016]在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
[0017]以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，所述Tris溶液浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M，所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
[0018]所述流动相B初始比例为0％，流动相B比例由0％升至100％的洗脱阶段为两个，且其中至少一次流动相B的比例升至100％后，保持稳定的100％比例10～12min，优选为10min。
[0019]在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
[0020]以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，所述Tris溶液浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M，所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
[0021]所述流动相B初始比例为20％，流动相B比例由20％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相B比例由20％升至100％的时间为25～26min，优选为26min。
[0022]在可选的实施方式中，所述色谱条件为：
[0023]以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，所述Tris溶液浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M，所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；
[0024]所述流动相B初始比例为50％，流动相B比例由50％升至100％的洗脱阶段为一个，且流动相B比例由50％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
[0025]第二方面，本专利技术提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：
[0026]以含乙腈的Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，流动相A和流动相B的流速为0.8～1.2/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；
[0027]所述Tris溶液的浓度为20mM，所述流动相A中乙腈的体积分数为4％～6％，优选为5％，所述流动相B中NaCl的浓度为4M，所述流动相B初始比例为25％，流动相B比例由25％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相B比例由25％升至100％的时间为25～26min，优选为25.8min。
[0028]第三方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法在硫代寡聚核苷酸纯化中的应用。
[0029]在可选的实施方式中，所述硫代寡聚核苷酸包括含有22～24个核苷酸的硫代寡聚核苷酸，例如22、23或24个核苷酸。
[0030]本专利技术提供的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法操作简便且成本低廉，经过验证，其检测结果中目标峰保留时间误差＜1min，峰面积RE＜10％，纯度RE＜3％满足寡聚核苷酸纯化需求，且稳定性好，重复性高，适宜实际生产推广应用。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1为本专利技术实施例1色谱检测结果；
[0033]图2为本专利技术实施例2色谱检测结果；
[0034]图3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法，其特征在于，所述液相色谱为阴离子交换高效液相色谱，包括以下色谱条件：以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，流动相A和流动相B的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱温度：48～52℃，检测波长：260nm；流动相梯度设置包括以下(a)～(c)中任一种：(a)流动相B初始比例为0％，且流动相B比例由0％升至100％的洗脱阶段至少为两个；(b)流动相B初始比例为20％，流动相B比例由20％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相B比例由20％升至100％的时间为20～30min；(c)流动相B初始比例为50％，流动相B比例由50％升至100％的洗脱阶段至少为一个，且流动相B比例由50％升至100％的时间为29～31min。2.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为19～21mM，所述流动相B中NaCl的浓度为3.9～4.1M。3.根据权利要求2所述的液相色谱分离方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M。4.根据权利要求2所述的液相色谱分离方法，其特征在于，流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度：50℃。5.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法，其特征在于，所述色谱条件为：以Tris溶液为流动相A，以含NaCl的Tris溶液为流动相B，所述Tris溶液浓度为20mM，所述流动相B中NaCl的浓度为4M，所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min，色谱柱温度50℃，检测波长：260nm；所述流动相B初始比例为0％，流动相B比例由0％升至100％的洗脱阶段为两个，且其中至少一次流动相B的比例升至100％后，保持稳定的100％比例10～12min，优选为10min。6.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：商元宵，薛韦良，李志浩，史力，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：