治疗性多价HPVmRNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，尤其是涉及治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法。本发明专利技术提供的mRNA分子利用核糖体跳跃元件对E6和E7基因进行连接能够同时表达HPV的E6和E7双抗原。将其与mRNA疫苗其他元件组合得到的治疗性mRNA分子经脂质纳米颗粒包封后，能够在体内和体外同时成功表达HPV的E6和E7双抗原。经过实验验证，本发明专利技术提供的mRNA疫苗能够有效同时表达双抗原蛋白E6和E7，并且通过LNP包封制备成mRNA疫苗免疫小鼠后，可以诱导产生较高的血清抗体水平，同时激发机体发生TH1和TH2型细胞免疫应答反应。疫应答反应。疫应答反应。

【技术实现步骤摘要】
治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物制药
，尤其是涉及治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的主要因素，近年来，我国宫颈癌患病率和死亡率逐步上升，并且趋向年轻化。我国现有宫颈癌患者约四十万人，死亡率达11.30％，远高于发达国家5％的死亡概率。其中，50％的宫颈癌与HPV 16感染相关。在我国主要是HPV 16，18，52和58型感染。针对HPV感染引起的宫颈癌，目前有多种疫苗(2阶、4阶、9阶)上市，然后这些疫苗都是预防性疫苗(Renjie Wang,Wei Pan,et al.(2020).Human papillomavirus vaccine against cervical cancer:Opportunity and challenge)。如果人体已经感染HPV，现有疫苗不能阻止潜在的病变或肿瘤发展，因此研发治疗性HPV疫苗是目前HPV研究领域的重点。
[0003]细胞介导的免疫反应而不是体液免疫对于清除HPV感染和杀伤肿瘤细胞很重要。研究表明，HPV感染的自发清除和HPV持续感染与机体强的细胞介导的免疫反应有关，主要涉及TH1型细胞和分别来自CD4+和CD8+T细胞诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(Gemma Hancock,Karin Hellner et al.,(2017).Therapeutic HPV vaccines)。目前HPV治疗性疫苗研究主要包括多肽疫苗、蛋白质疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗等(Andrew Yang,Emily Farmer,T.C.Wu et al.(2016).Perspectives for therapeutic HPV vaccine development)。多肽疫苗是将预测的抗原表位通过化学技术进行合成，直接注射体内以引起抗肿瘤细胞反应。多肽疫苗耐受性、稳定性较好并且易于大规模生产，但是多肽疫苗在不同个体具有MHC
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I类限制性，不一定对所有接种过疫苗的人有效。此外，多肽疫苗往往免疫原性较低，并且必须配合其他免疫调节剂一起使用，例如Toll样受体(TLR)激动剂，细胞因子和共刺激分子等。蛋白质疫苗具有免疫表位，规避了MHC
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I类分子限制性问题，但是主要诱导体液免疫应答而非细胞免疫，每次免疫需要较高的剂量并且需要伴随着佐剂使用，免疫效果较弱。病毒载体疫苗研究的较为详细，它可以诱导良好的细胞免疫和体液免疫效果，并且免疫剂量较小，如图1所示，其中LITR/RITR为左/右反向末端重复序列，ES为包装信号序列，CMV为启动子序列，CRT为钙网蛋白的编码序列，E7为E7蛋白编码序列，(Jorge G,Gomez
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Gutierrez et al.,(2007),Vaccination with an adenoviral vector expressing calreticulin
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human papillomavirus 16 E7 fusion protein eradicates E7 expressing established tumors in mice)。
[0004]但是，针对病毒载体疫苗预存的免疫反应仍是目前需要克服的困难，另外病毒基因有整合宿主基因组的风险。DNA疫苗具有生产简易、成本低，易于保存、不会引起载体免疫反应等优点，可以通过优化载体基因、DNA结构和共表达免疫刺激分子等方式产生更好的抗肿瘤细胞效果和中和反应。由于其复杂的免疫方式(如电穿孔、基因枪)常导致免疫接种困难、免疫效力不足，并且DNA疫苗还存在整合宿主基因组的风险，因此目前较难应用和推广
(Ken Lin,Barbara Ma et al.,(2010),Therapeutic HPV DNA vaccines)。
[0005]mRNA疫苗平台为第三代疫苗研发技术，该疫苗研发技术具有如下优点：(1)安全性强。mRNA并不会感染机体或者整合进基因组，因此不会带来感染或突变的风险。(2)免疫效果较好。通过多种修饰方式和包封使mRNA更佳稳定，并且可以诱导产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答。(3)生产的便捷性。通过体外转录技术能够快速、大规模生产mRNA疫苗，相较于传统疫苗5
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6个月或更长的生产周期，可以实现几十天内完成mRNA疫苗样品的生产制备，可以更高效地应对突发的传染病疫情。
[0006]图2给出了现有治疗性HPV mRNA疫苗的常用制备思路。首先合成HPV16的致癌基因E6和E7，利用分子克隆技术将其插入真核表达载体pVAX1中，构建pVAX1
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E6E7重组质粒。经单酶切后制备线性化DNA，体外转录成包含E6E7的mRNA。然后通过阳离子脂质纳米颗粒(LNPs)包封制备成mRNA疫苗。相同制备方式制备GFP mRNA
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LNPs，通过体外转染，检测报告基因GFP和抗原的表达。小鼠模型免疫实验检测免疫mRNA疫苗后，小鼠血清IgG抗体、细胞因子TNF
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α、IFN
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γ、IL
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4、T细胞亚群和抑制肿瘤生长情况(周茜.2019.HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究)。
[0007]尽管上述方法成功得到mRNA疫苗，但是其技术原理是基于DNA疫苗设计思路开发的mRNA，存在一些不足之处，其质粒序列不包含有完整的5
′
UTR和3
′
UTR调控序列，并且体外转录过程未使用化学修饰的碱基。研究证实未进行有效修饰处理的mRNA会显著影响其在体内的稳定性和翻译效率，导致mRNA被机体降解，并且容易诱发机体产生不良的免疫反应，影响最终的免疫治疗效果。另外，技术路线中通过(G3S)4作为linker将E6和E7蛋白实现串联融合表达，容易造成上下游蛋白表达量的差异，从而影响蛋白功能的发挥。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于，充分发挥mRNA分子相对于蛋白和DNA分子的优势，提供一种mRNA分子，使得其能够在体内或体外独立表达多价抗原。经含有该mRNA分子的mRNA疫苗免疫后，机体能够同时针对多个抗原诱导产生体液和细胞免疫应答，从而获得更优的免疫效果。
[0010]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0011]第一方面，本专利技术提供mRNA分子，所述mRNA分子包括核糖体跳跃元件连接的至少两个编码片段，所述编码片段编码的多肽具有HPV病毒肽表位免疫原性；
[0012]所述HPV病毒肽表位包括蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1或L2；
[0013]所述核糖体跳跃元件选自P2A、F2A、T2A、E2A或F2A30；
[0014]所述核糖体跳跃元件的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子包括核糖体跳跃元件连接的至少两个编码片段，所述编码片段编码的多肽具有HPV病毒肽表位免疫原性；所述HPV病毒肽表位包括蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1或L2；所述核糖体跳跃元件选自P2A、F2A、T2A、E2A或F2A30；所述核糖体跳跃元件的5
′
端通过连接序列连有弗林蛋白酶样序列，所述弗林蛋白酶样序列编码的短肽中碱性氨基酸所占比例为50％～100％；所述连接序列编码的短肽为(GSG)
n
AP，所述n为1～4。2.根据权利要求1所述的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子的核苷酸序列由5
′
端至3
′
端包括依次连接的第一编码片段、弗林蛋白酶样序列、连接序列、核糖体跳跃元件和第二编码片段；所述第一编码片段和第二编码片段均独立地编码具有E6或E7免疫原性的多肽，且不相同；所述弗林蛋白酶样序列编码的短肽优选为R
m
X
n
R
o
，所述m为1～2；X为Q、F或H；n为0～2；o为1～2；所述核糖体跳跃元件优选为F2A。3.根据权利要求2所述的mRNA分子，其特征在于，编码具有E6免疫原性多肽的核苷酸序列如Seq_1(优化后的HPV16 E6)所示；编码具有E7免疫原性多肽的核苷酸序列如Seq_2(优化后的HPV16E7)所示；或者，编码具有E6免疫原性多肽的核苷酸序列如Seq_3(优化后的HPV18E6)所示；编码具有E7免疫原性多肽的核苷酸序列如Seq_4(优化后的HPV18E7)所示。4.权利要求1～3任一项所述mRNA分子在制备治疗性mRNA疫苗中的应用。5.治疗性mRNA分子，其特征在于，所述治疗性mRNA分子包括依次连接的5
′
UTR元件、信号肽元件、权利要求1～3任一项所述的mRNA分子和3
...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮宝阳，曹玉锋，田文莉，刘林，张金城，张智，史力，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：